第三講細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為分析方法

1、第三講細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為分析方法一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長、繁殖(proliferation)和死亡(death)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)是描述細(xì)胞狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。(1)生長曲線(growth curve)的測定：記錄細(xì)胞的絕對生長數(shù)值，了解細(xì)胞總體的(global)增殖生長規(guī)律。(2)分裂指數(shù)的測定：記錄細(xì)胞群體中分裂期細(xì)胞(cell at mitotic phase)所占百分比，用以表示細(xì)胞增殖旺盛程度。(3)細(xì)胞增殖指數(shù)：新增殖(newly generated )的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。(4)集落（克?。┬纬蓪?shí)驗(yàn)：測定單個(gè)細(xì)胞(single cell)增殖

2、能力。一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (1)生長曲線的測定對比生化、物理刺激、基因改造前、后細(xì)胞生長特性的差異反映細(xì)胞生長特性：對數(shù)生長期（傳代）、倍增時(shí)間(doubling time)等在培養(yǎng)瓶或孔板中準(zhǔn)確接種相同數(shù)量的細(xì)胞，每天計(jì)數(shù)(count everyday)，測出培養(yǎng)瓶或孔板中的細(xì)胞總數(shù)，持續(xù)7天（也可根據(jù)需要而定）。細(xì)胞接種量以7天能長滿，而不發(fā)生接觸抑制(contanct inhibition)為度。一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (1)生長曲線(growth curve)的測定血球計(jì)數(shù)板Tips:(1)數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右；(2)每一大方格細(xì)胞數(shù)104=細(xì)胞數(shù)/mL(3)可用臺(tái)盼藍(lán)(

3、trypan blue)染色區(qū)分活、死細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)法(cytometry)23一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (1)生長曲線的測定原理：活細(xì)胞線粒體(mitochondrion)中脫氫酶(dehydrogenase)能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。用酶標(biāo)儀(microplate reader)測定OD值即可獲得間接的細(xì)胞數(shù)量表征。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，可一次處理多個(gè)樣品。由于脫氫酶非細(xì)胞數(shù)量的直接表征，常被審稿人詬病。類似方法：WST、MTS、XTT、CCK8

4、等。MTT（四唑鹽）法酶標(biāo)儀搖床96孔板一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (1)生長曲線的測定XTT法原理：XTT是異種與MTT類似的四唑氮衍生物，可被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原成水溶性的棕色(brown)甲肷產(chǎn)物，當(dāng)XTT與電子耦合劑（PMS）共同使用時(shí)，甲肷的生成量與細(xì)胞的增殖程度呈正相關(guān)。MTS法原理：與MTT法原理類似。MTS是MTT的類似物，能被活細(xì)胞線粒體中脫氫酶還原成可溶于水的有色產(chǎn)物甲臜鹽，可直接進(jìn)行比色。特點(diǎn)：步驟相對MTT更簡單，相對更準(zhǔn)確。WST-1法原理：與MTS原理類似。檢測范圍寬于MTT和MTS。CCK8法原理：基于WST-8。在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫

5、酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (1)生長曲線的測定各種細(xì)胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (2)分裂指數(shù)(mitotic index)測定于細(xì)胞培養(yǎng)載玻片上進(jìn)行，定時(shí)取出玻片進(jìn)行固定染色，并觀察計(jì)數(shù)，也可將數(shù)據(jù)繪制成曲線。細(xì)胞培養(yǎng)載玻片骨髓細(xì)胞Giemsa染色細(xì)胞分裂過程熒光染色一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (3)BrdU摻入法測定細(xì)胞增殖指數(shù)5-溴脫氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶的衍生物，可以通過與胸腺嘧啶競爭摻入到S期細(xì)胞單鏈DNA中，再利用抗Br

6、dU單克隆抗體顯示增殖細(xì)胞核。通常用DAPI和BrdU熒光染色復(fù)染的方法來分析細(xì)胞的增殖情況。BrdU competes with thymine in the synthesis of DNA during proliferation. Anti-BrduDAPIBrdU摻入法根據(jù)選擇抗體標(biāo)記物的不同，還可以通過免疫組化(IHC)、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、ELISA檢測細(xì)胞的增殖情況。同類方法：EdU法一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (4)集落形成(colony forming)實(shí)驗(yàn)單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)生長，其后代所形成的細(xì)胞群稱為克隆或集落。該方法可對單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，也常用來確定抗

7、癌藥物對腫瘤的殺傷能力。常用的方法包括平板集落形成實(shí)驗(yàn)（貼壁細(xì)胞）和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)（懸浮細(xì)胞）。CFU-ECFU-GM一、細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)檢測方法 (4)集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色Crystal violet二、細(xì)胞凋亡(apoptosis)檢測技術(shù)細(xì)胞死亡有兩種不同形式，即細(xì)胞壞死(necrosis)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞壞死是由外界因素導(dǎo)致的細(xì)胞急速死亡；凋亡是細(xì)胞在生理(physiological)或病理(pathological)條件下由基因(gene)調(diào)控的死亡過程。細(xì)胞凋亡過程中膜結(jié)構(gòu)完整(integral membrane)，染色體DNA斷裂(DNA fragmen

8、tation)，細(xì)胞膜包裹這核碎片形成凋亡小體(apoptosis body)。凋亡在胚胎發(fā)育、成年階段衰老、病變細(xì)胞的清除發(fā)揮著重要的作用，也是研究藥物作用機(jī)理和進(jìn)行藥物篩選的的重要手段。常用檢測方法：1. 形態(tài)觀察(morphology)2. DNA瓊脂糖凝膠電泳(electrophoresis)3. MTT細(xì)胞活性檢測4. 流式細(xì)胞儀分析(FACS)5. 原位末端標(biāo)記（TUNEL）二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù) (1)形態(tài)觀察可通過HE染色，Giemsa染色等方法觀察凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，凋亡小體等現(xiàn)象，也可用電鏡、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡。電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Hoechst33258染色細(xì)胞核觀察凋

9、亡二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù) (2)DNA瓊脂糖凝膠電泳agarose electrophoresis細(xì)胞凋亡最突出的生化特征是由凋亡引起的核酸內(nèi)切酶(endonuclease)的活化，使染色質(zhì)核小體(nucleosome)間連接斷裂，DNA裂解為長度為180200bp及其倍數(shù)的片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)DNA梯形電泳圖譜。二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù) (3)凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記法（TUNEL）凋亡細(xì)胞染色體DNA的斷裂首先降解為50300kb的大片段，然后在核小體間隨機(jī)斷開，形成180200bp的小片段。脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶（TDT）的作用下，生物素或熒光素標(biāo)記的dUTP可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈D

10、NA的3-OH端，通過顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位凋亡細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：是分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法，并可檢測出早期和極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度比DNA Ladder法高。二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù) (4)流式細(xì)胞儀檢測凋亡（PI單染色）溴化丙錠（propidium iodide, PI）可與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合，流式細(xì)胞術(shù)檢測到的PI熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。凋亡細(xì)胞由于總DNA量降低，將于正常G1/G0期細(xì)胞群前出現(xiàn)一亞二倍峰，即凋亡細(xì)胞群。G1/G0期：正常細(xì)胞（2N）；G2/M期：分裂的細(xì)胞（4N）；S期：細(xì)胞DNA含量介于前兩者之間。缺點(diǎn)：無法區(qū)分死細(xì)胞與凋亡細(xì)胞，對早期凋亡也無法檢測

11、。二、細(xì)胞凋亡檢測技術(shù) (4)流式細(xì)胞儀檢測凋亡（AnnexinV-PI雙染色）磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）分布于細(xì)胞內(nèi)膜，凋亡細(xì)胞PS外翻。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。三、細(xì)胞遷移/侵襲檢測技術(shù)細(xì)胞遷移（migration）和侵襲（invasion）的概念最初來自于腫瘤學(xué)。侵襲是指惡性腫瘤細(xì)胞從起源部位沿組織間隙向周圍組織浸潤的過程，其標(biāo)志是腫瘤細(xì)胞突破基底膜。腫瘤侵襲是腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)相互作用的結(jié)果。細(xì)胞侵襲的研究側(cè)重于細(xì)胞與胞外基質(zhì)（ECM）的相互作用。三、細(xì)胞遷移(migration)/侵襲(invasion)檢測技術(shù)細(xì)胞

12、遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后產(chǎn)生的移動(dòng)。過程中細(xì)胞不斷向前方伸出突足(pseudopodium)，然后牽拉胞體的循環(huán)過程。細(xì)胞骨架(cytoskeleton)和其結(jié)合蛋白(binding proteins)是這一過程的物質(zhì)基礎(chǔ)，另外還有多種物質(zhì)對之進(jìn)行精密調(diào)節(jié)。細(xì)胞遷移側(cè)重于研究細(xì)胞的趨化性(chemotaxis)和運(yùn)動(dòng)性(motility)。三、細(xì)胞遷移/侵襲檢測技術(shù) (1)Transwell 法檢測細(xì)胞遷移Transwell chamber也叫做通透性細(xì)胞培養(yǎng)支持物，孔徑的膜主要應(yīng)用于藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)研究，細(xì)胞遷移、侵襲、趨化性和運(yùn)動(dòng)性研究通常采用以上孔徑的膜。一般遷移

13、/侵襲實(shí)驗(yàn)使用8m直徑的膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用結(jié)晶紫(crystalviolet)或DAPI等染色觀察遷移細(xì)胞數(shù)目。 control 0.1 g/ml 0.5 g/ml 1 .0 g/ml OPN 三、細(xì)胞遷移/侵襲檢測技術(shù) (2)劃線法檢測細(xì)胞遷移劃線法又叫做wound healing法，是體外模擬體內(nèi)傷痕愈合過程的實(shí)驗(yàn)方法。三、細(xì)胞遷移/侵襲檢測技術(shù) (3)Transwell法檢測細(xì)胞侵襲基底膜(basementmembrane)是普遍存在的一種連續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)成份構(gòu)成的膜性結(jié)構(gòu)，主要含層粘連蛋白(laminin)和膠原(collagen)。局部蛋白質(zhì)水解導(dǎo)致基底膜降解有利于腫瘤細(xì)胞的穿出。常

14、用的人工基底膜材料為Matrigel。三、細(xì)胞遷移/侵襲檢測技術(shù) (4)微流控法檢測細(xì)胞遷移、侵襲VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移Migrating cells into soft (pH 7.4) and rigid (pH. 11.0) scaffolds were studied.Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue).共培養(yǎng)條件誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移MTLn3： GFP-expressing rat mammary adenocarcinoma cells (乳腺癌

15、細(xì)胞)U87MG： GFP-expressing human glioblastoma cell line （膠質(zhì)瘤細(xì)胞）10T ： Mouse smooth muscle precursor cells （平滑肌祖細(xì)胞）Cells were stained for actin by Rhodamine-phalloidin (yellow) and nuclei by DAPI (blue).HMVEC （內(nèi)皮細(xì)胞）were stained for vWF(green) to distinguish them from 10T 1/2.四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (1)微管吸吮技術(shù)(Mic

16、ropipette Aspiration Technique, MAT)原理：采用微管吸吮方法捕獲表征特異性相互作用分子的細(xì)胞或小球，通過壓電晶體驅(qū)動(dòng)器操控微管，實(shí)現(xiàn)兩細(xì)胞或小球間靠近-接觸-回拉的動(dòng)力學(xué)循環(huán)，并記錄回拉過程中細(xì)胞變形與否、變形大小和解離時(shí)間長短等信息來研究分子間相互作用(interaction between molecules)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。優(yōu)點(diǎn):可直觀觀察粘附事件的發(fā)生(directly observe the adhesion events)，而且每次粘附事件均可控。局限性:在于通量低、每次只能實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞對檢測，且由于測試周期較長、體外難以長時(shí)間維持細(xì)胞功能狀態(tài)的限制

17、，難于獲得大樣本的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。Long M, 2007, JBC, Two-dimensional Kinetics of P-selectin-PSGL-1 Interactions四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (1)微管吸吮技術(shù)四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (2)光鑷技術(shù)(optical tweezers)光是一種特殊的物質(zhì)，攜帶有能量和動(dòng)量，光與物質(zhì)相互作用時(shí)彼此交換能量和動(dòng)量，產(chǎn)生各種效應(yīng)。捕獲微小粒子的光鑷是一個(gè)特別的光場，這個(gè)光場與物體相互作用時(shí)，物體整個(gè)受到光的作用從而達(dá)到被鉗的效果，然后可以通過移動(dòng)光束來實(shí)現(xiàn)遷移物體的目的。光鑷可以捕獲和操控幾十納米到幾十微米大小的粒子(opti

18、cal tweezer can capture particles with diameters of dozens of nanometer/micrometer )，它還可以作為微小力的探針，測量皮牛亞皮牛量級(jí)的力，正好可以用來研究生物細(xì)胞的力學(xué)行為，以及細(xì)胞與生物大分子如蛋白質(zhì)等的相互作用等，進(jìn)而從單細(xì)胞、單分子層次上揭示細(xì)胞生命活動(dòng)的基本規(guī)律。四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (2)光鑷技術(shù)細(xì)胞水平上：1. 操控細(xì)胞，高選擇性分選細(xì)胞和細(xì)胞器；2. 誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生形變，研究細(xì)胞應(yīng)變能力；3. 研究細(xì)胞彈性；利用光鑷移動(dòng)2微米的粒子利用光鑷移動(dòng)紅細(xì)胞（視頻）利用光鑷研究紅細(xì)胞張力分子水平上：1

19、. 操控生物大分子，如DNA的扭轉(zhuǎn)打結(jié)，可使DNA分子比肌動(dòng)蛋白還強(qiáng)壯，用于縫合細(xì)胞和神經(jīng)的細(xì)微手術(shù)；2. 研究單分子力學(xué)特性，如DNA折疊動(dòng)力學(xué)，蛋白運(yùn)動(dòng)特性等；四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (2)光鑷技術(shù)利用光鑷對DNA打結(jié)（knot）利用光鑷研究動(dòng)力蛋白的運(yùn)動(dòng)四、細(xì)胞生物力學(xué)特性檢測技術(shù) (3)原子力顯微鏡(atomic force microscope ,AFM)原子力顯微鏡是一種可用來研究固體材料表面結(jié)構(gòu)(surface structure of materials)的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個(gè)微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。Phase contrast image (top left), Fluorescence image (bottom left), AFM height image (top right, scan range 0 - 3.2 m) and AFM