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1、第6章蒸發(fā)電泳分離技術(shù)1概述過程特點第一節(jié)電泳基本概念 1、電泳是指帶電荷的供試品(蛋白質(zhì)、核甘酸等)在惰性支持介質(zhì)中(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)在電場作用下向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行泳動,使組分分離成狹窄區(qū)帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。電泳技術(shù)是實驗室中分析、鑒定和分離技術(shù)之一。2概述過程特點第一節(jié)電泳基本概念2、電泳分類:3概述過程特點第二節(jié) 電泳分離基本原理 帶電粒子在電場中產(chǎn)生定向遷移,引起其遷移所受力(F)與電場強度(E)和粒子所帶凈電荷(Z)成正比:粒子在電場中所受力與溶液黏度、分子半徑、及穩(wěn)態(tài)下移動速度有關(guān)4各種不同分

2、子量的蛋白質(zhì)在電場內(nèi)遷移速率與它的凈電荷數(shù)成正比,而與其分子半徑及溶液黏度成反比。實驗證明,蛋白質(zhì)的電泳遷移速率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)成線性關(guān)系5根據(jù)此性質(zhì),可對具有相同電荷,不同分子量的蛋白質(zhì)進行分離。6電泳技術(shù)分類影響電泳遷移率的因素 電場強度。電場強度是指單位長度(cm)的電位降也稱電勢梯度。根據(jù)電場強度不同,將電泳分為常壓電泳(2-10V/cm)和高壓電泳(20-200V/cm)。電場強度高,帶電質(zhì)點的遷移率加速,因此省時,但會產(chǎn)生大量熱量。 7溶液的pH值。溶液的pH值決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。對于帶有兩性基團的電解質(zhì),溶液存在一pH值,此時,溶液所帶正負

3、電荷相等,即分子的凈電荷等于零,此時,在電場中不再移動,這一pH值稱為電解質(zhì)的等電點(isoelectric point, PI)。若溶液pH值處于等電點酸側(cè),即pHp I,則蛋白質(zhì)帶正電荷,在電場中向負極移動;若溶液pH值處于等電點堿側(cè),即pHpI,則蛋內(nèi)質(zhì)帶負電荷,向正極移動。溶液的pH值離pI越遠,質(zhì)點所帶凈電荷越多,電泳遷移率越大。8 溶液的離子強度一方面,電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點遷移率的降低。帶電質(zhì)點吸引相反電荷的離子聚集其周圍,形成一個與運動質(zhì)點電荷相反的離子氛(ionic atmosphere),離子氛不僅降低質(zhì)點的帶電量,同時增加質(zhì)點前移的阻力,甚至使其不能泳動。另一

4、方面,離子濃度過低,會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量,不易維持溶液的pH值,影響質(zhì)點的帶電量,改變泳動速度。9電滲。在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲(electroosmosis)。由于電滲的影響,質(zhì)點遷移的表觀速度不同于其固有速度。因固體支持物多孔,且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團,因此常吸附溶液中的正離子或負離子,使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時,紙上纖維素吸附OH-帶負電荷,而與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+,帶正電荷移向負極,若質(zhì)點原來在電場中移向負極,結(jié)果質(zhì)點的表觀速度比其固有速度要快;若質(zhì)點原來移向正極,表觀速度比其固有速度要慢。因此應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少

5、電滲的影響。10電泳的技術(shù)問題和對策:影響遷移速率的主要因素(1)各組分的分子凈電荷數(shù);(2)分子量;(3)電泳系統(tǒng)介質(zhì)的有效黏滯度。(1)一般控制溶液pH4.5-9.5范圍內(nèi)。(2)選擇適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)。(3)表面活性劑(4)控制電泳系統(tǒng)介質(zhì)的有效黏滯度11(5)電泳過程的產(chǎn)熱問題A、蛋白質(zhì)變性;B、引起區(qū)帶擴散,降低分辨率。最常采用的辦法是將電泳產(chǎn)生的熱量從電泳系統(tǒng)中移出,保持電泳溫度恒定。12概述過程特點第11章 色譜分離過程色譜法指多種成分的混合物,由于在流動相和固定相中有不同的分配,在流動過程中,經(jīng)多次分配后而獲得分離。同其他傳統(tǒng)分離純化方法相比,色譜分離過程具有如下特點。1、應(yīng)用范圍

6、廣2、分離效率高3、操作模式多樣4、高靈敏度在線檢測13概述過程特點色譜分離過程的基本原理 色譜分離過程的實質(zhì)是溶質(zhì)在不互溶的固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次的交換過程,它借各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等差異而使不同的溶質(zhì)分離 。即混合物中各個組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱而得到分離。1415概述過程特點 固定相 色譜柱填料分為球形顆粒填料和不規(guī)則形狀顆粒填料。具有較高的機械強度,不易破碎,柱的填裝重視性好,并可增加樣品在柱中的滲透性。色譜分離過程常用柱填料有以下幾種。(1)硅膠衍生的固定相;(2)活性炭;(3)離子交換樹脂;(4)大孔吸附樹脂;(5)凝膠;(6

7、)手性固定相. 16概述過程特點色譜柱及柱技術(shù) 色譜柱是色譜技術(shù)的核心, 色譜柱的性能依賴于三個因素:色譜柱填充技術(shù)、柱設(shè)計和生產(chǎn)。(1)色譜柱填裝方法17概述過程特點(2)色譜柱設(shè)計以使被分離物質(zhì)以“面進樣”而不是“點進樣”的方式分布在柱頭截面上,形成平整的活塞流,減少譜帶擴張。 18概述過程特點 色譜的分類 1、按兩相狀態(tài)分類按流動相狀態(tài)分類氣相色譜(GC); 液相色譜(LC);超臨界流體色譜(SFC)。按固定相狀態(tài)分類氣-固色譜(GSC);氣-液色譜(GLC)液-固色譜(LSC);液-液色譜(LLC)19概述過程特點 色譜的分類 2、按處理量分類根據(jù)分離樣品量的不同,以分離純化為目的的色

8、譜可分為:半制備(semi-preparative,微克級至克級)、大規(guī)模(Large scale,克級至千克級)、生產(chǎn)型 (industrial scale or process,克級至千克級)幾種類型色譜。20概述過程特點 色譜的分類 3、按分離機制分類分子排阻色譜或凝膠過濾色譜(size exclusion chromatography,SEC或gel filtration chromatography,GC)。離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)。21概述過程特點 色譜的分類 3、按分離機制分類疏水作用色譜(hydrophobic intera

9、ction chromatography,HIC)。親和色譜(affinity chromatography,AC)。正相/反相色譜(normal/reversed phase chromatography,N/R PC22概述過程特點 色譜的分類 3、按使用目的分類分析用色譜制備用色譜流程用色譜23概述過程特點 色譜分離過程基礎(chǔ)理論 保留值、分離度和柱效應(yīng)(1)保留值 保留值通常以保留時間 及容量因子 來表示。 保留值是色譜過程的基本熱力學(xué)參數(shù)之一。它也是色譜定性的基本依據(jù)。 從進樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間,與固定相和流動相的性質(zhì)、柱溫、流速、柱體積等因素有關(guān)。 2

10、4概述過程特點 色譜分離過程基礎(chǔ)理論容量因子指在一定溫度和壓力下,組分在固定相和流動相之間達到平衡時的質(zhì)量之比。它與柱尺寸及流速無關(guān),而與溶質(zhì)在兩相間的分配性質(zhì)、柱溫及固定相和流動相之體積比有關(guān)。25概述過程特點 色譜分離過程基礎(chǔ)理論 保留值、分離度和柱效應(yīng)(1)分離度 相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以兩色譜峰的平均寬度。 當(dāng)R=1時,兩色譜峰的分離程度可達94%;當(dāng)R=1.5時,兩個色譜峰已完全分離。 26概述過程特點色譜分離過程基礎(chǔ)理論 保留值、分離度和柱效應(yīng)(1)柱效應(yīng):用塔板高度和塔板數(shù)衡量色譜柱效應(yīng) 。 有效塔板數(shù)和有效塔板高度 27概述過程特點色譜分離過程基礎(chǔ)理論 色譜理論模型 (1)

11、速度方程理論 A、B、C分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)和傳質(zhì)阻力項系(2)平衡色譜理論假定在整個過程中,色譜柱中不存在傳質(zhì)阻力,溶質(zhì)在固定相和流動相中分配平衡能瞬間完成。28概述過程特點色譜分離過程基礎(chǔ)理論 即在色譜柱內(nèi)任何時刻和位置,溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度均符合等溫方程 由于忽略了非理想流動及各種傳質(zhì)阻力的存在,這個模型是比較粗略的。 29概述過程特點色譜分離過程基礎(chǔ)理論(3)塔板理論 塔板理論將色譜過程比擬為蒸餾過程,不同色譜柱看成是由一系列理論塔板所組成。在一個理論板當(dāng)量高度HETP的柱高內(nèi),溶質(zhì)在兩相間達到一次平衡。由塔板理論可計算理論塔板數(shù)及塔板高度.但它是半經(jīng)驗式理論,

12、不能揭示色譜過程本質(zhì)。30概述過程特點色譜分離過程基礎(chǔ)理論(4)軸向擴散理論 在色譜過程中,組分在流動相中的軸向擴散是影響色譜區(qū)域譜帶擴張的主要因素,而有限的傳質(zhì)速率對區(qū)域譜帶擴張沒有影響。軸向擴散理論的基本方程為 軸向擴散理論考慮了溶質(zhì)在流動相和固定相間的傳質(zhì)速率及流動相的流動狀態(tài),當(dāng)傳質(zhì)速率較快而軸向擴散為區(qū)域擴張的主要因素時,該理論具有較好的指導(dǎo)意義。31概述過程特點氣相色譜及其應(yīng)用 氣相色譜儀以惰性氣體(載氣)作為流動相,以固定液或固體填充劑作為固定相的色譜設(shè)備。處理的對象是低分子量或易揮發(fā)化合物。不適宜高分子化合物及熱敏性化合物的分離和分析。32概述過程特點氣相色譜及其應(yīng)用氣相色譜儀氣路系統(tǒng)(氣源、凈化器、氣流控制裝置);進樣系統(tǒng)(注射器、六通閥、自動進樣器);分離系統(tǒng)(色譜柱、柱箱);檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。33概述過程特點高效液相色譜及其應(yīng)用高效液

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