培養(yǎng)基以及其配制課件課件

1、關(guān)于培養(yǎng)基及其配制課件第一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第一節(jié)培養(yǎng)基成分及作用第二張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月主要成分包括：無機鹽類（大量和微量元素）、維生素類、氨基酸類、有機附加物、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、糖類，水和瓊脂等。 1.大量元素：指濃度大于0.5mmol

2、L的元素等。(1)N：是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等 的組成成分，在制備培養(yǎng)基時以NO3N和NH4N兩種 形式供應。(2)P：是磷脂的主要成分。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04 (3)K：對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。 制備培養(yǎng)基時，常以KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和Ca、Mg： 是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO47H20提供。Ca是構(gòu)成細胞壁的一種成分，Ca對細胞分裂、保護質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl22H2O提供。 第三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2.

3、微量元素：指小于0.5mmolL的元素主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。 鐵是一些氧化酶、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分。同時，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進作用。在制做培養(yǎng)基時不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO47H20和Na2EDTA結(jié)合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導致生長、發(fā)育異?，F(xiàn)象。 第四張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3.有機化合物碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也

4、是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。蔗糖使用濃度在2%3%，常用3%高壓滅菌時，一部分糖會發(fā)生分解，制定配方時要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。 維生素：這類化合物主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進作用。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0.11.0mgL。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。第五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月生長培養(yǎng)基是植物再生

5、的必要條件蔗糖 （0%）蔗糖含量（ 1%）蔗糖含量（ 5%）外植體完全被綠色的芽所包裹，根生長在其下表面在外植體上既沒有芽發(fā)生，也沒有根和愈傷組織產(chǎn)生在外植體上表面邊緣產(chǎn)生芽，也有一些根發(fā)生芽從外植體的上表面發(fā)生而根從下表面發(fā)生tissue culture in the African Violet 第六張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)肌醇又叫環(huán)己六醇：在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度一般為l00mgL，適當使用肌醇，能促進愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細胞的繁殖、分化有促進作用，對細胞壁的形成也有作用。 氨基酸：是很好的有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)

6、基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。4.有機附加物：其對細胞和組織的增殖與分化有明顯的促進作用，但對器官的分化作用不明顯。其成分大多不清楚，所以一般應盡量避免使用。 常用的有機附加物有:椰乳：香蕉：水解酪蛋白：第七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5.植物生長調(diào)節(jié)物植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動，在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。

7、 5.1生長素類(auxin)： 在組織培養(yǎng)中，生長素主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長。在促進生長方面，根對生長素最敏感，在極低的濃度下，就可促進根生長，其次是莖和芽。天然的生長素熱穩(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。一般生長素濃度的使用為0.055mgL。第八張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出

8、3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細胞分裂素互作促進芽的增殖和生長。IBA(吲哚丁酸)是促進發(fā)根能力較強的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進愈傷組織的形成上活力最高，但它強烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應。第九張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5.2細胞分裂素類細胞分裂素多用于誘導不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時使用較少或用量較低。這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6芐基氨基嘌呤)、Kt (kinetin 激動素)、

9、Zt (zeatin 玉米素)等，細胞分裂素0.0510mgL。 其中Zt活性最強，但非常昂貴，常用的是6BA。在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素有三個作用：誘導芽的分化促進側(cè)芽萌發(fā)生長。促進細胞分裂與擴大。抑制根的分化。第十張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5.3激素配比模式生長素與細胞分裂素：它們的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進芽器官的分化，應除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。 高：有利于根的形成和愈傷組織的形成； 適中：有利于根芽的分化； 低：有利于芽的形成生長素/細胞分裂素比例第十一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月No

10、 BAPBAP reduced to 0.1 mg. l-1 No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generationPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explantProfuse developm

11、ent of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant第十二張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callusNo MS saltsNo sign of regeneration from

12、explant at all.MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shootsMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.第十三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月GA (赤霉素)：有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和

13、生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當生長素赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進器官或胚狀體的生長。第十四張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月6.抗生物質(zhì)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%10%的抗菌素。第十五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月活性炭的應用：莖尖初代培養(yǎng)，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，一般為0.1%0.2%，不能超過0.2%

14、?；钚蕴吭谏鶗r有明顯的促進作用，可能是通過減弱光 照保護IAA。降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用，一般濃度為0.3%。7.活性炭活性炭結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用通常使用濃度為0.5l0gL。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)。 第十六張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時向培養(yǎng)基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭

15、加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動培養(yǎng)瓶?？傊?，那種隨意抓一撮活性炭放人培養(yǎng)基，會帶來不良的后果。因此，在使用時要有其量的意識，使活性炭發(fā)揮其積極作用。第十七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月、瓊脂瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40即凝固為固體狀凝膠。通常所說的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90以上的熱水。瓊脂條的用量在610gL之間，瓊脂粉的用量在34gL之間。若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散到

16、培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。新買來的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。第十八張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 培養(yǎng)基配制及注意事項第十九張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月(一) 母液配制的目的 方便配置其他培養(yǎng)基；保證各物質(zhì)成分的準確性及配制時的快速移取 (二) 母液配制方法（一）單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。（二）混配法：將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用a mg/L表示，

17、即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液a ml.一、培養(yǎng)基母液的配制第二十張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）母液配制的藥品與器材1、藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL2、器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標簽、冰箱等。第二十一張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例） 有機物母液鐵鹽母液無機大量 母液無機微量母液激素母液第二十二張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月配制MS培養(yǎng)基時母液的計算第二十三張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、無機大量母液(擴大10倍配1L

18、 )成 分硝酸鉀硝酸銨 硫酸鎂磷酸二氫鉀氯化鈣稱量工具托盤天平注意：無機大量母液中的各種物質(zhì)在混合過程中有些離子易產(chǎn)生沉淀，應使每種物質(zhì)先充分溶解，再進行混合，而且鈣鹽最后緩慢加入進去。第二十四張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月硼酸，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鋅，氯化鈷，鉬酸鈉，碘化鉀托盤天平和電子天平2、無機微量母液（擴大100倍配1000ml）稱量工具成分第二十五張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、鐵鹽（擴大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，Na2-EDTA注意：鐵鹽采用托盤天平稱取。鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因為它溶解后易產(chǎn)生紅色的氫氧化鐵沉淀。第二十六張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、有機物（擴大50倍500ml）有機物甘氨酸VB1VB6煙酸肌醇注意：有機物中的物質(zhì)均采用托盤天平和電子天平 稱取。第二十七張，PPT共三十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5、激素母液（常用的）生長素NAA，IBA，2,4-D，IAA細胞分裂素6-BA，KT，GA，ZT注意：這些激素配制時，一般配成1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量95%酒精助溶。2，