SDS-PAGE檢測(cè)分析

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮W(xué)習(xí)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的基本原理和操作方法。2蔗糖酶分離純化產(chǎn)物的SDSPAGE檢測(cè)分析。學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）的方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，作定向運(yùn)動(dòng)即向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳法分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶凈電荷多少等因素所產(chǎn)生的電泳遷移率的差別。區(qū)帶電泳：是樣品物質(zhì)在一惰性支持物上進(jìn)行電泳,因電泳后，樣品不同組分形成帶狀區(qū)間，故稱(chēng)區(qū)帶電泳。4聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel,簡(jiǎn)稱(chēng)PAG）是由丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)試劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（B

2、is）在有引發(fā)劑（如過(guò)硫酸銨或核黃素）和增速劑（如N,N,N,N-四甲基乙二胺，TEMED）的情況下聚合而成的。CH|nCH2-cococoNHNEINH2NH!COTOC o 1-5 h z-CH2CH-CH2COCOCOIIIHHNH2NHj彈NHICO5.聚丙烯酰胺凝膠.電泳（PAG*）是在恒定的、非解離的緩沖系統(tǒng)中來(lái)分離蛋白質(zhì)，這主要是由蛋白質(zhì)樣品所帶的電荷和分子質(zhì)量的差異性進(jìn)行分離；在電泳過(guò)程中仍保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、亞基之間的相互作用及其生物活性。結(jié)構(gòu)連續(xù)系統(tǒng)：凝膠緩沖液的pH值及凝膠濃度不變。該電泳系統(tǒng)具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)；不連續(xù)系統(tǒng)：凝膠緩沖離子成分、pH值、凝膠濃度、電位

3、梯度不連續(xù)，由濃縮膠和分離膠組成。由于濃縮膠的堆積（濃縮）作用，可使樣品（即使是稀釋樣品）在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，然后在一定濃度（或一定濃度梯度）的凝膠上進(jìn)行分離。該電泳系統(tǒng)具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。7.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）以PAG為支持物的電泳，由于各種蛋白質(zhì)所帶靜電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。為消除靜電荷對(duì)遷移率的影響，在整個(gè)電泳體系中加入一定量的陰離子去污劑“十二烷基硫酸鈉（簡(jiǎn)稱(chēng)SDS）”和“強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）”后，蛋白質(zhì)樣品就會(huì)與SDS結(jié)合形成帶負(fù)電荷復(fù)合物，而SDS作為一種變性劑和助溶劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的非共價(jià)鍵，

4、并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象。另外，SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）存在下，可打開(kāi)蛋白質(zhì)分子內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，并能避免重新氧化，這樣分離出的譜帶即為蛋迤亞基。蛋白質(zhì)亞基的電泳的遷移率主要取決于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量大小，而電荷的因素可以忽略。8蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)方法在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的SDS時(shí)，蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，約為1.8nm，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率

5、，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只主要取決于它的橢圓棒的長(zhǎng)度即蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，而其他因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。由于蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量不同，所形成復(fù)合物的相對(duì)分子質(zhì)量不同，在電泳中反映出不同的遷移率。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或亞基的相對(duì)分子質(zhì)量在15,000200,000之間時(shí)，電泳遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈直線(xiàn)關(guān)系，符合下列方程式：lgMr=KbRf式中Mr代表相對(duì)分子質(zhì)量，K代表常數(shù)，b代表斜率，Rf代表遷移率。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

6、。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑1實(shí)驗(yàn)材料：蔗糖酶樣品(樣品I、II、III、W)2實(shí)驗(yàn)試劑：30.8%凝膠貯液：丙烯酰胺(Acr)30g,甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g,加水溶解，并加水定容到100ml,過(guò)濾。貯于棕色瓶，可在4C保存一個(gè)月。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體及溶液是中樞神經(jīng)毒物,要小心操作。分離膠緩沖液：3mol/LTris-HClpH8.9濃縮膠緩沖液：0.5mol/LTris-HClpH6.710%SDSTEMED(N,N,Z,NZ-四甲基乙二胺)(增速劑)10%過(guò)硫酸銨(引發(fā)劑)電泳緩沖液(pH8.3)：Tris6g，甘氨酸28.8g,SDS2g，用蒸餾水溶解并定至1000ml，使用

7、時(shí)稀釋1倍。蛋白質(zhì)樣品溶解液(2X蛋白質(zhì)樣品溶解液)：內(nèi)含1%SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.01mol/LTris-HClpH8.0緩沖液。染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250或G-250，加90.8ml50%甲醇，加9.2ml乙酸，溶解混勻后使用。脫色液：75ml乙酸，50ml甲醇，加蒸餾水875ml，混勻使用。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液：P-半乳糖苷酶(MW116,000)牛血清白蛋白(MW66,200)卵清蛋白(MW45,000)乳酸脫氫酶(MW35,000)限制性?xún)?nèi)切酶Bsp981(MW25，000)P-乳球蛋白(MW18,400)雞蛋清溶菌酶(MW1

8、4,400)四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1電泳儀、垂直電泳槽及配件（長(zhǎng)短玻璃板各1塊、封膠條2條、梳子1個(gè)）微量移液器：1000M1、200p1、10pl3燒杯、長(zhǎng)滴管微量注射器50p1恒溫水浴100C高速臺(tái)式離心機(jī)離心管（1.5ml、0.5ml）及離心管架8.015cm培養(yǎng)皿（染色、脫色用）9.搖床（染色、脫色用）五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備電泳裝置：電泳槽、電泳儀。2.配膠及凝膠的制備（1）配制凝膠：不連續(xù)體系SDS聚丙烯酰胺凝膠配制3%分離嘲濡商量（訕5%糧縮膠所需試劑量（ml）3O.S%JS膠貯液20.353nmLLTris-HCIpHS.9分離膠鉤中菠0.950.5nioLLTriHCIpH

9、6.7淞宿膠緩菠0.3210%SDS0.0750.Q25TEMED0.0030.003蒸憐K4.51.S10%Ap0.G4G0.020:總、為去除抑制膠聚合的氧，加入、AP前可進(jìn)行抽氣處理；2、過(guò),硫酸銨和TEMED的量應(yīng)根據(jù)室溫聚合情況而定；3、混勻后立即灌注凝膠和用手封頂。凝膠板的制備分離膠的制備：按上表配制7.5ml分離膠，混合均勻后將凝膠液加至長(zhǎng)、短玻璃板間的縫隙內(nèi)，再用少許蒸餾水（或水飽和的異丙醇或正丁醇）沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入，約5mm高，以封住膠面，以促使聚合并使膠面平直，約30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線(xiàn)，則表示凝膠完全聚合，傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多

10、余的水分。濃縮膠的制備：按上表配制2.5ml濃縮膠，混勻后將濃縮液加到已聚合的分離膠上方，直至離短玻璃板上得約0.1cm處，輕輕將樣品槽模板（梳子）插入濃縮膠內(nèi)，約lOmin后凝膠聚合。小心拔去樣品槽的槽板（梳子），將電泳緩沖液倒入上、下貯槽中，電泳緩沖液應(yīng)沒(méi)過(guò)短板約0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。樣品處理與加樣（1）樣品制備取蔗糖酶樣品（樣品I、II、III、W）各50ul,分別放入1.5ml離心管中，12000r/min離心15min,收集上清為樣品溶液。（2）樣品處理將樣品溶液分別按等體積加入“2XSDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液”，100C保溫3分鐘。（3）加樣用微量注射器向樣品槽內(nèi)注入310“1樣品混合液。如樣品濃度較低，可適當(dāng)增加上樣量。樣品markerIIIinIV-1W-2IV-3W-4上樣*(pl)533310101010電泳在電泳槽中加入電泳緩沖液，上槽（加樣孔端）接負(fù)極、下槽接正極，接電泳儀電源電流控制在23mA/樣品孔，一般樣品進(jìn)濃縮膠前，電流控制在1020mA，待樣品進(jìn)分離膠后，將電流調(diào)到2030m