殼聚糖羥基磷灰石支架修復(fù)骨軟骨缺損的實驗研究

1、殼聚糖/羥基磷灰石支架修復(fù)骨軟骨缺損的實行研究王文良張華亮關(guān)靜，初殿偉【摘要】目的探究雙層殼聚糖hitsanS/羥基磷灰石復(fù)合支架(hydrxyapatiteHA)修復(fù)兔骨軟骨缺損的可行性。要領(lǐng)接納凍干法和燒結(jié)法制作雙層殼聚糖S/羥基磷灰石HA復(fù)合支架，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，運(yùn)用纖維卵白膠蒔植技能，以雙層殼聚糖S/羥基磷灰石HA復(fù)合支架為載體，修復(fù)骨軟骨缺損，實行分3組，A組：BS+支架，B組：單純支架，組：未處置懲罰。將修復(fù)質(zhì)料植入骨軟骨缺損模子，別離于6、12周取材，舉行大要不雅察，構(gòu)造學(xué)檢測，改進(jìn)akitani法評分，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處置懲罰，比力各組修復(fù)結(jié)果差異P0.05。結(jié)果1S/H

2、A支架S層孔隙率為76%5.01%，孔徑為200400,均勻為300擺布，孔相通性好，HA層孔隙率為72%4.23%，孔徑為200500,均勻為350擺布，孔相通性好，結(jié)合部結(jié)合好；2P2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較純，掃描電鏡不雅察Ss附著在復(fù)合支架上。大要不雅察和構(gòu)造學(xué)檢測表現(xiàn)，A組根本修復(fù)軟骨缺損，骨缺損有骨小梁長入。B、組骨軟骨缺損修復(fù)不良，構(gòu)造學(xué)檢測以纖維性構(gòu)造或無新生構(gòu)造形成，軟骨及骨缺損均顯著存在，改進(jìn)akitani評分表現(xiàn)A組在6周、12周2個時間點(diǎn)的各項評分結(jié)果，均優(yōu)于B、組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論雙層殼聚糖S/羥基磷灰石HA復(fù)合支架可作為骨軟骨構(gòu)造工程支架，結(jié)合BS可

3、修復(fù)軟骨與骨的缺損，重修樞紐的剖解布局和成效?！娟P(guān)鍵詞】殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架;構(gòu)造工程;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;骨軟骨缺損Keyrds：hitsan/hydrxyapatitebilayeredsaffld;stehndraltissueengineering(TE)；bneesenhyalsteells(BS);bnedefet如今軟骨損傷生物學(xué)修復(fù)的金尺度是自體軟骨移植。只管臨床研究結(jié)果證明自體軟骨移植大多數(shù)病例獲得了很好的療效，但生物學(xué)和臨床上所面對的挑釁是損傷軟骨的完全修復(fù)和成效重修。如今仍有兩個重要的題目必要器重：1有研究表白由于外傷，病理改變和因年事等因素相干的樞紐軟骨病變多陪同著

4、軟骨下骨的病變，而軟骨下骨病變，又可以影響其上軟骨的新陳代謝，形成惡性循環(huán)，加重軟骨病變乃至生長為骨性樞紐炎，影響軟骨的恒久修復(fù)結(jié)果1、2；2新生的修復(fù)構(gòu)造與四周宿主骨與軟骨構(gòu)造的彼此整合的題目，即新生構(gòu)造與宿主四周的骨軟骨缺乏安穩(wěn)的錨定3，如今大多數(shù)軟骨構(gòu)造工程并沒有辦理這個題目。為了辦理這兩個題目，本實行接納模擬樞紐骨軟骨構(gòu)造學(xué)布局的S/HA支架，結(jié)合兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，同時修復(fù)免膝樞紐骨軟骨缺損模子。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1動物及重要試劑圖1S/HA支架的宏不雅布局1.2實行要領(lǐng)稱取S溶于醋酸配成濃度為3%(/v)殼聚糖溶液,同時參加聚乙二醇，離心去除氣泡。將HA支架先放入的模具中，取配好的殼

5、聚糖溶液，倒入模具中成形，放入冰箱冷凍，在冷凍抽干機(jī)中凍干，制成殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架，中和支架內(nèi)的醋酸溶液，重復(fù)PBS液沖洗，至pH值中性。別離用傅立葉紅外光譜儀測定質(zhì)料性子；乙醇交換法丈量其孔隙率4，掃描電鏡不雅察復(fù)合支架孔徑的巨細(xì)及內(nèi)部布局。將支架泡入75%的酒精30in，紫外線照耀30in消毒。網(wǎng)絡(luò)兔自體P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞D1，調(diào)解細(xì)胞密度為2107/l，按文獻(xiàn)4運(yùn)用纖維卵白膠蒔植技能體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體，將支架細(xì)胞復(fù)合物移入37、5%2及飽和濕度條件下孵育4h，再遲鈍地參加細(xì)胞造就液中。再在37、體積分?jǐn)?shù)為5%的2及飽和濕度條件下孵育10h，預(yù)備植入兔膝樞紐骨軟骨缺損模子

6、內(nèi)。戊二醛結(jié)實支架細(xì)胞復(fù)合體，掃描電鏡SE不雅察細(xì)胞在支架上生長的環(huán)境。兔膝樞紐骨軟骨缺損的制備及細(xì)胞-支架復(fù)合體的植入：36只日本大耳白兔，3個月齡巨細(xì)，體重20.2kg,取右膝樞紐，共36膝，隨機(jī)分為3組，每組12膝，A組，復(fù)合支架+干細(xì)胞，B組，復(fù)合支架，組，未處置懲罰。肌肉注射速眠新0.2l/kg麻醉動物，通例消毒鋪巾，依次切開臏韌帶外側(cè)緣，充實表露股骨下端外側(cè)髁負(fù)重區(qū)，在其上做一個直徑4，深度達(dá)3的圓柱形缺損，鉆穿軟骨下骨，掃除缺損內(nèi)的血凝塊后，置入細(xì)胞支架復(fù)合物或單純支架或不作處置懲罰，無菌生理鹽水沖洗樞紐腔，分層縫合。別離在6、12周取材，截取修復(fù)的股骨遠(yuǎn)端，4%多聚甲醛結(jié)實48

7、h，20%的EDTA鈉鹽脫鈣3周、每周調(diào)換脫鈣液2次，白臘包埋切片。不雅察指標(biāo)為：術(shù)后一樣平常環(huán)境，修復(fù)構(gòu)造大要不雅察，HE染色及甲苯胺藍(lán)染色等構(gòu)造學(xué)不雅察。并按照改進(jìn)的akitani評分法舉行半定量評分5。接納SPSS11.0統(tǒng)計軟件包舉行闡發(fā)，數(shù)據(jù)以均數(shù)尺度差表現(xiàn)，接納方差闡發(fā)，SNK法舉行兩兩比力，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1雙層殼聚糖S/羥基磷灰石HA復(fù)合支架(圖a)的理化性子檢測2.2細(xì)胞支架復(fù)合物修復(fù)兔膝樞紐骨軟骨缺損模子圖6e、6、6a別離是空缺組、支架組、支架細(xì)胞組動物實行12周時軟骨修復(fù)環(huán)境甲苯胺藍(lán)，圖7e、7、7a別離是空缺組、支架組、支架細(xì)胞組動物實行12周時軟

8、骨修復(fù)環(huán)境甲苯胺藍(lán)圖6f、6d、6b別離是空缺組、支架組、支架細(xì)胞組動物實行6周時軟骨下骨修復(fù)環(huán)境HE圖7f、7d、7b別離是空缺組、支架組、支架細(xì)胞組動物實行12周時軟骨修復(fù)環(huán)境HE，圖中N指正常構(gòu)造、R指修復(fù)構(gòu)造、IF指接壤處。2.3S/HA支架復(fù)合體修復(fù)兔膝樞紐骨軟骨缺損，改進(jìn)akitani評分值A(chǔ)組優(yōu)于B、組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(表2。表2改進(jìn)akitani評分值注：*A組與組比P0.05,*A組與B組比P0.053討論3.1殼聚糖/羥基磷灰石支架作為骨軟骨構(gòu)造工程支架的可行性抱負(fù)的骨軟骨構(gòu)造工程支架質(zhì)料應(yīng)具有以下特性:(1)精良的生物相容性及生物寧靜性；(2)三維立體布局孔隙率應(yīng)到達(dá)90

9、%以上,并具有很大的內(nèi)外貌積,孔隙直徑均勻為150擺布;(3)精良的外貌活性，應(yīng)可以或許促進(jìn)骨軟骨細(xì)胞粘贊同增殖;(4)生物可落解性，支架在構(gòu)造形成歷程中應(yīng)漸漸被落解,而且不影響新天生構(gòu)造的布局和成效;(5)可塑性，可被加工成所必要的外形并具有必然的機(jī)器強(qiáng)度,并使新形成的構(gòu)造具有切合方案的外形;6質(zhì)料泉源和代價具有商品化的遠(yuǎn)景6。殼聚糖是天然界普及存在的一種天然多糖類有機(jī)聚合物，它的分子布局和軟骨基質(zhì)糖氨多糖(GAG)布局相似，具有精良的生物相溶性和可落解性，對軟骨細(xì)胞有較好的吸附作用，可促進(jìn)細(xì)胞在質(zhì)料上的增殖與分化7、8，是軟骨構(gòu)造工程中較相宜的支架質(zhì)料。Nettles等9將豬軟骨細(xì)胞接種于

10、冷凍枯燥法制備的殼聚糖多孔支架中,于旋轉(zhuǎn)生物反響器中造就,經(jīng)甲苯胺藍(lán)及免疫構(gòu)造化學(xué)檢測,創(chuàng)造軟骨細(xì)胞保持球形,并有大量卵白聚糖和型膠原排泄。羥基磷灰石是人體骨的重要無機(jī)質(zhì)身分，不但能傳導(dǎo)成骨，而且能與新骨形成骨鍵合，具有精良的生物相溶性。Brittberg等10以為HA含有的鈣、磷身分在機(jī)體中可以產(chǎn)生略微的溶解,溶解的鈣、磷與四周骨構(gòu)造的鈣離子、磷離子形成化學(xué)鍵11,與四周的軟骨下骨的骨原細(xì)胞精細(xì)結(jié)合,隨著時間的推移,骨原細(xì)胞漸漸進(jìn)入支架,并向骨細(xì)胞演變,長入HA的微小孔隙中,并漸漸交換載體,規(guī)復(fù)軟骨下骨的正常布局。在我們的實行中，雙層殼聚糖/羥基磷灰石支架具有符合孔徑和孔隙率。得當(dāng)構(gòu)造工程支

11、架要求，支架質(zhì)料與細(xì)胞具有精良的相溶性，因此，殼聚糖/羥基磷灰石支架是骨軟骨構(gòu)造工程支架質(zhì)料的抱負(fù)選擇。3.2殼聚糖/羥基磷灰石支架的方案骨軟骨構(gòu)造工程旨在同時修復(fù)退變的骨軟骨，是辦理軟骨退變的較抱負(fù)的措施。骨軟骨構(gòu)造工程支架要求有雷同于骨軟骨構(gòu)造學(xué)布局，即軟骨樣層和軟骨下骨樣層。Athanasiu等12最早提出“雙相載體，雷同正常樞紐骨軟骨的構(gòu)造形態(tài)，疏松部門內(nèi)部空間大，包容的細(xì)胞多，軟骨前體細(xì)胞接種后在這種三維體造就中彼此作用，可形成樞紐面的軟骨層。致密部門強(qiáng)度高，植入樞紐骨軟骨缺損后可支持新形成的軟骨構(gòu)造，起到軟骨下骨板的作用。他構(gòu)建的“雙相聚乳酸聚乙醇酸載體有相對致密的軟骨下骨區(qū)和相對

12、疏松的軟骨區(qū)。我們的實行表白，S模擬軟骨樣層，HA模擬軟骨下骨層。結(jié)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，軟骨層得到了較好的修復(fù)，甲苯胺藍(lán)異染性強(qiáng)，修復(fù)以透明軟骨為主；軟骨下骨層得到了部門修復(fù)，大概是時間不敷和HA落解慢的緣故原由造成的。但實行組優(yōu)于比較組說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合在HA上是可以修復(fù)軟骨下骨的。3.3體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)支架細(xì)胞復(fù)合物修復(fù)骨軟骨缺損。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和支架復(fù)合體修復(fù)骨軟骨缺損是必要必然的外界環(huán)境。外洋有學(xué)者將細(xì)胞支架復(fù)合體在體外環(huán)境下誘導(dǎo)成骨與軟骨。auney將Ss復(fù)合在部門礦化的三維支架上，置于骨誘導(dǎo)液在動態(tài)生物反響器中造就，造就16d后堿性磷酸酶活性高于靜態(tài)比較組，說明動態(tài)生物

13、反響器中應(yīng)力刺激下有利于Ss向成骨標(biāo)的目的分化13。hang方案了一種可以或許造就雙相支架細(xì)胞復(fù)合物的雙室生物反響器，用于同時體外構(gòu)建軟骨構(gòu)造，體外造就4周后創(chuàng)造軟骨細(xì)胞形成14。Ss向軟骨及骨標(biāo)的目的誘導(dǎo)分化是綜合性因素。在體外難于完全模擬出符合的誘導(dǎo)環(huán)境，體內(nèi)微環(huán)境是Ss誘導(dǎo)分化的天然環(huán)境，它包羅種種生物因子，理化刺激，力學(xué)環(huán)境等因素，因此有學(xué)者提出了體內(nèi)生物反響器的觀點(diǎn)，即要充實使用體內(nèi)局部的如血運(yùn)、種種理化因子刺激種子細(xì)胞等等來以更高的速率和更好的質(zhì)量形成新的目的構(gòu)造。Stevens用脛骨和骨膜制作了一個空間，使用此空間含有的富厚的間充質(zhì)干細(xì)胞，用于自體內(nèi)修復(fù)機(jī)制構(gòu)造工程化新構(gòu)造骨，用于對側(cè)脛骨缺損的修復(fù)。本實行接納凍干法，預(yù)先將S/HA支架毗連在