植物病原菌分離方法

1、第四章植物病原菌分!1!離與純化植物病原菌一、植物病原菌分離流程二分離的準(zhǔn)備分離的準(zhǔn)備工作無(wú)菌室操作前保持清潔無(wú)菌接種工作準(zhǔn)備培養(yǎng)基的準(zhǔn)備分離材料選擇以收獲的材料從病健交界處采樣果實(shí)腐爛從開(kāi)始腐爛處分離根腐和枯萎層可能從離土較遠(yuǎn)處分 離有些枯萎如野火病被固定在局部， 從病斑邊緣分不到等有些材料污染嚴(yán)重時(shí)可先接種再分 離：即將病組織接種到健康材料等 發(fā)病后分離組織表面消毒 升汞：1%0升汞 1g HCl（濃）25ml 水 1000ml升汞先溶于鹽酸中，加水后稀釋，也 可用NaCl 5g/L代替鹽酸，但易沉淀作用：鹽酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增強(qiáng)殺菌能力。處理時(shí)間：30S-30min不等，

2、常35min ；所需時(shí)間因材料不同而異， 消毒后滅菌水35次附在組織表皮的氣泡，含使消毒劑不能與寄生表面直接通氣影響消毒 效果，除氣泡抽氣、70%酒精浸2 一3秒A漂白粉常用表面消毒劑適用于病組織表面消 毒，也可處理種子成分：漂白粉10g，水140ml，過(guò)濾后使 用。最好現(xiàn)配現(xiàn)用，放久失效，有效成分CaCl O次氯酸鈣好的消毒液易使有色紙褪色，且產(chǎn)生氯 氣有強(qiáng)烈臭味。一般35min，時(shí)間長(zhǎng)短因材料不同而 不同。處理種子510min，長(zhǎng)的可達(dá)20 30min。優(yōu)點(diǎn)：殺菌能力強(qiáng)，具有揮發(fā)性，不 會(huì)遺留在組織上影響分離結(jié)果，其殺 菌能力小于升汞。 (3)酒精：70%，浸很短時(shí)間（幾秒到1min）滅菌

3、水洗。較大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰燒去。幼嫩的病組織，表面用藥劑消毒 時(shí)可能會(huì)同時(shí)殺死其中的病原真 菌，消毒時(shí)間應(yīng)盡量縮短。比較 安全的方法是不用藥劑消毒，而 以滅菌水換洗八九次。培養(yǎng)基的準(zhǔn)備分離失敗的原因，有時(shí)是由于培 養(yǎng)基不適宜。寄生性細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基的要求要比腐 生性細(xì)菌嚴(yán)格。一種適宜于純培養(yǎng)的培養(yǎng)基不一定 適宜于分離（雜菌太多）有時(shí)分離失敗的原因不是培養(yǎng)基 的成分不適宜，而是由于培養(yǎng)基 的酸度不適當(dāng)或存放的時(shí)間太長(zhǎng)。植物病原菌的分離培養(yǎng)基，可以分為通用培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基。通用培養(yǎng)基不加特殊抑制雜菌 生長(zhǎng)的物質(zhì)；選擇性培養(yǎng)基一 般都要加制止雜菌生長(zhǎng)的物 質(zhì)。植物病原細(xì)菌分離時(shí)

4、，要避免使 用選擇性培養(yǎng)基，因?yàn)橐种齐s菌 的物質(zhì)一般并不殺死雜菌，而是 抑制雜菌的生長(zhǎng)，因此，從分離 單個(gè)菌落繁殖得到的菌株仍可能 三、有植物病原細(xì)菌的分離技術(shù)植物病原細(xì)菌一般用稀釋分 離方法。因?yàn)樵诓〗M織中病原細(xì)菌數(shù)量 巨大，分離材料中所帶的雜菌 又大多是細(xì)菌，用稀釋培養(yǎng)的 方法就可以使病原細(xì)菌與雜菌 分開(kāi)，形成分散的菌落，從而 較容易獲得植物病原細(xì)菌的純 培養(yǎng)。植物病原細(xì)菌分離常用的消 毒方法漂白粉溶液處理35min，然后 用無(wú)菌水沖洗次氯酸鈉溶液處理2min，然后用無(wú)菌水沖洗。分離培養(yǎng)基肉汁胨培養(yǎng)基（NA）馬鈴薯葡萄糖（或蔗糖）培養(yǎng) 基pH調(diào)節(jié)至6.5,稀釋分離法制備細(xì)菌懸浮液 取滅菌培

5、養(yǎng)皿加無(wú)菌水適量，切取 約4mm見(jiàn)方的小塊病組織，經(jīng)過(guò)表 面消毒和無(wú)菌水沖洗3次后，移在 無(wú)菌的研缽中將病組織研碎，靜置 1015min，使組織中的細(xì)菌進(jìn)入 水中置成懸浮液。配制不同稀釋度的細(xì)菌懸浮液準(zhǔn)備3-5個(gè)滅菌培養(yǎng)皿，每個(gè)皿加 200ul無(wú)菌水用滅菌移植環(huán)從第1個(gè)培養(yǎng)皿中移 植1-2環(huán)細(xì)菌懸浮液到第2個(gè)培養(yǎng)皿中，充分混合后再?gòu)牡?個(gè)培養(yǎng) 皿移植1-2環(huán)到第3個(gè)培養(yǎng)皿中， 依次類推，稀釋的次數(shù)根據(jù)病組織 中細(xì)菌的數(shù)量而定。置帶菌平板將熔化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45C 左右，分別倒入培養(yǎng)皿中，搖勻后 靜置冷卻，凝固后在培養(yǎng)皿蓋上標(biāo) 明分離材料、日期和稀釋編號(hào)等。 挑取單菌落，轉(zhuǎn)入斜面培養(yǎng)基。平板

6、劃線分離法制備細(xì)菌懸浮液劃線（動(dòng)畫(huà)）用滅菌移植環(huán)蘸取以上懸浮液 在表面已干的瓊脂平板上畫(huà)線， 先在平板的一側(cè)順序畫(huà)35條 線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60，將移植 環(huán)經(jīng)火焰灼燒滅菌后，從第2條線末端用相同方法再畫(huà)35條 線。也有其他畫(huà)線形式，如四分 畫(huà)線和放射狀畫(huà)線等，其目的都 是使細(xì)菌分開(kāi)形成分散的菌落。貼標(biāo)簽分離材料和日期等培養(yǎng)及結(jié)果觀察1=挑取單個(gè)菌落接種于斜面培 養(yǎng)基上，如果不純，再移植純 化，最后得到純培養(yǎng)。若分離成功，瓊膠平板上菌落 形狀和大小比較一致，即使出 現(xiàn)幾種不同形狀的菌落，終有 1種是主要的。如果菌落類型很多，且不分主 次，很可能未分離到病原細(xì) 菌，應(yīng)考慮重新分離。如果不熟悉1種細(xì)菌

7、菌落的性 狀，就應(yīng)選擇幾種不同類型的 菌落，分別培養(yǎng)以后接種測(cè)定 其致病性，最終確定病原細(xì) 菌。一種細(xì)菌病害一般是由一種 病原細(xì)菌引起的，瓊膠平板上 出現(xiàn)幾種不同類型的菌落，實(shí) 質(zhì)上只有一種是真正的病原 細(xì)菌。腐爛型的細(xì)菌病害即是混合侵染的，但也有一種是主要 的。各種植物病原細(xì)菌生長(zhǎng)快慢不同假單胞菌屬和歐文氏菌屬細(xì) 菌：12天土壤桿菌屬細(xì)菌：23天黃單胞菌屬細(xì)菌：34天棒桿菌屬的細(xì)菌：5-8d才出現(xiàn) 明顯的菌落。瓊膠平板上菌落的觀察主要是：形狀和大小、顏色和光澤、表 面是否隆起或凹陷、邊緣的形 狀、透明度和粘度、培養(yǎng)基顏色的變化等。在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)植物病原細(xì)菌菌苔形狀的差異 一般是比較

8、小的。菌苔的表面 有光滑的、不平整的和有皺褶 的、易挑取、質(zhì)地均勻。菌苔的顏色也不同，質(zhì)地有粘 質(zhì)的、膜質(zhì)的或蠟質(zhì)的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的， 表面有H首色的或發(fā)亮的。菌落正反面或邊緣與中央部位 顏色一致等特征。四、植物病原真菌的分!1!病原真菌的種類繁多，其分 離的方法不同，而同一種材 料又可用不同的方法分離。常用的分離法可以分為兩大 類，即組織分離和稀釋分離 法。稀釋分離法適用于分離細(xì)菌和酵母，一般 很少用于分離真菌，但大量產(chǎn) 抱的病原真菌和霉菌也用將抱子懸浮液與熔化并冷卻至U45C的培養(yǎng)基混勻，倒平 板，但難于掌握溫度，也可平 板涂布。 組織分離法（真菌）切取小塊病健交界處的病

9、組 織，經(jīng)表面消毒和滅菌水洗過(guò) 以后，移在瓊膠培養(yǎng)基平板上 培養(yǎng)，待真菌長(zhǎng)出后挑取菌絲 進(jìn)行純化，得到植物病原真菌 的分離方法。囊菌和半知菌等大多數(shù)真菌 用常規(guī)組織分離法分離組織分離法步驟環(huán)境的清潔和消毒分離用具的消毒分離材料的選擇培養(yǎng)基平板制備病組織用水沖洗分離材料表面消毒分離材料接種將剪成2-3毫米大小組織用滅菌鑷子夾 取放入培養(yǎng)基平板上，輕輕按壓。每皿 4-5塊，排放均勻。貼標(biāo)簽和培養(yǎng)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)放置于23-25C培養(yǎng)3-4 日純化挑選由分離材料上長(zhǎng)出的典型而無(wú)雜 菌的菌落，在菌落邊緣用移菌針挑取帶 有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面 培養(yǎng)基中央，于25 C溫箱中培養(yǎng)。細(xì)菌的排除將培養(yǎng)基

10、調(diào)節(jié)至酸性環(huán)境，10ml培 養(yǎng)基中加3滴25%的乳酸加孟加拉紅，配培養(yǎng)基時(shí)加入35mg/L加抗生素，除氯霉素外，其余均滅 菌后加入金霉素：抑制多數(shù)細(xì)菌（30ug/ml）青霉素：抑制G+細(xì)菌，20ug/ml多粒霉素B：抑制G-細(xì)菌（5ug/ml）鏈霉素：40ug/ml氯霉素：50ug/ml，大部分細(xì)菌真菌有菌絲可穿透培養(yǎng)基，而細(xì)菌 無(wú)這種能力，先將真菌接種倒平板 上，然后再加一層Agar，菌絲透過(guò) 而在表面生長(zhǎng)加玻片，加玻棒，利用氣生菌絲甩 掉細(xì)菌。病原真菌的分離舉例斑點(diǎn)病病原真菌分離：取5 5 mm2組織f 70%消毒幾秒f 無(wú)菌水洗3次一升汞消毒3 一 5minf無(wú)菌水洗3次f接種 維管束內(nèi)

11、病原真菌分離：70% 酒精表面消毒f切去表面f接種根腐病菌病原真菌分離：由材料大小決定：大一；小f肉質(zhì)組織中病原真菌分離：采 用種子內(nèi)病原真菌分離：整粒種子表面消毒，水洗后f接 種到平板種子如在未裂開(kāi)果莢中可不消 毒接種到平板孢子分離法配成抱子懸浮液以稀釋法或劃 線分離法青霉(Pencillium)鏈孢菌屬(Alternaria)小叢殼屬(Glomerelia)莖點(diǎn)菌屬(Phoma)擬莖點(diǎn)菌屬(Phomopsis)曲霉特殊類型真菌的分離采用特殊的方法分離特殊的培養(yǎng)基；如集抱粘菌：(Acraciomycetes) 以E.coli為食專性寄主的用誘餌分離采用特殊的培養(yǎng)條件溫度pH如立枯絲核菌的分離

12、方法誘餌法離心法A快速生長(zhǎng)法五、影響病原菌分離失敗的原因從以下幾個(gè)方面尋找原因材料：新鮮？病菌活否。雜菌 滋生狀況消毒劑及處理方法適宜否培養(yǎng)基是否適宜，包括理化性 狀培養(yǎng)條件符合菌的生物學(xué)特性，其對(duì)腐生條 件的適應(yīng)能力六、病原菌的純化技術(shù)研究植物病原菌的遺傳、變異 性征，同異親配合，都要求菌種單孢不同的病原菌純化方法好壞 依人而異。平板稀釋純化法A混菌法滅菌水沖洗f大致稀釋（每皿30個(gè)菌 左右）一取一定量菌液懸浮液與熔化后 45 r培養(yǎng)基混勻f合適溫度培養(yǎng)f形 成菌落f移植平板涂布法取菌液0.1mlf滌布f靜5min或無(wú)菌 風(fēng)吹干f倒置培養(yǎng)應(yīng)用范圍細(xì)菌、酵母、產(chǎn)抱多真菌純化優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：

13、不能看到和不能一個(gè)菌落是 從單抱繁殖而來(lái)，純化可靠性差。應(yīng)用范圍：細(xì)菌、酵母、產(chǎn)孢多真菌等細(xì)胞較大的植物病原菌純化稀釋純化法將抱子（細(xì)胞）懸浮液中加適 量滅菌水一不斷稀釋再一小 滴懸浮液f鏡檢f只有一個(gè) 孢子的懸浮液f移植平板表面單孢分離法：取法玻璃毛細(xì)管分離法單孢子分離法顯微操作儀分離法七、真菌的培養(yǎng)性狀植物病害方面，培養(yǎng)真菌的目 的主要是觀察它的性狀和研 究環(huán)境條件對(duì)它的影響，或者 是大量繁殖后用于接種或其 他試驗(yàn)。培養(yǎng)的方法是將純化的菌種， 根據(jù)試驗(yàn)的要求，移植在適當(dāng) 的固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 后者可以靜止或振蕩培養(yǎng)。固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)靜f動(dòng)培養(yǎng)性狀的觀察觀察和記載的項(xiàng)目主要是：菌落的質(zhì)

14、地；菌落形成是凸起的或者有成簇的菌絲 體；形成成堆的孢子是干的或粘性的；各種子實(shí)體和休眠結(jié)構(gòu)(厚垣孢子、菌 核等)的形成和所需的時(shí)間；菌落正面和背面的顏色，有無(wú)色素參入 培養(yǎng)基中；有無(wú)特殊氣味；菌落中有沒(méi)有部分呈扇狀；生長(zhǎng)率的快慢，如菌落長(zhǎng)到一定直徑所 需的時(shí)間。菌落的顏色也要不斷地觀 察，它的顏色是隨著時(shí)間而改變的。培養(yǎng)性狀的描述，要注明培養(yǎng)基的 種類、培養(yǎng)溫度和有無(wú)光照等。真菌培養(yǎng)性狀的觀察，最好多用幾種培 養(yǎng)基。如鐮刀霉屬(Fusarium )和青霉屬(Penicillium)等，在各種培養(yǎng)基上的八、植物病原定菌帷長(zhǎng)量測(cè)定植物病原微生物特別是單細(xì)胞微生物，體積很小，個(gè)體生 長(zhǎng)很難測(cè)定，意

15、義也不大。通常測(cè)定微生物的生長(zhǎng)是測(cè) 群體的生長(zhǎng)，測(cè)定繁殖則都要 建立在計(jì)數(shù)基礎(chǔ)上。植物病原細(xì)菌生長(zhǎng)量測(cè)定法直接法測(cè)體積粗放的方法，將待測(cè)培養(yǎng)液放在刻度離 心管中作自然沉降或進(jìn)行一定時(shí)間的 離心，然后觀察沉降物的體積。稱干重采用離心法或過(guò)濾法測(cè)定，一般干重為 濕重的10%20%。離心法（細(xì)菌）將待測(cè)培養(yǎng)液離心，再用清水洗滌離心 15次后干燥，可用105C、100C或 紅外線烘干，或在較低的溫度（80C 或40C）下進(jìn)行真空干燥，然后稱干重?？谌缂?xì)菌一個(gè)細(xì)胞一般重 10-i210-i3g。過(guò)濾法絲狀真菌用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖 維膜等濾膜過(guò)濾。過(guò)濾后，細(xì)胞可用少量水洗滌，再真空 干燥（40C以下

16、），稱干重。間接法生理指標(biāo)法與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多， 它們均可用作生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。測(cè)細(xì)胞總含氮量大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%含氮量的測(cè)定方法有很多，常用凱氏定 氮法。含碳量的測(cè)定微生物新陳代謝的結(jié)果，必然要消耗或 產(chǎn)生一定量的物質(zhì)，以表示微生物的生 長(zhǎng)量。 一般生長(zhǎng)旺盛時(shí)消耗的物質(zhì)就多，或者 積累的某種代謝產(chǎn)物也多。將少量生物材料混入1ml水或無(wú)機(jī)緩沖 液中，用2ml 2%重鉻酸鉀溶液在100C 下加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至 5ml，在580nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值推 算出生長(zhǎng)量。其它磷、DNA、RNA、ATP和 N 乙酰胞 壁酸等的含量，

17、以及產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、產(chǎn) CO2 （用標(biāo)記葡萄糖作基質(zhì)）、耗氧、 粘度和產(chǎn)熱等指標(biāo)，均可用于生長(zhǎng)量的 測(cè)定。比濁法A微生物在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， 由于細(xì)胞含量的增加，引起培 養(yǎng)物混濁度的增高。最古老的McFarland比濁法，用 不同濃度的BaCl 2與稀H2SO4配 制成的10支試管，其中形成的 BaSO4有10個(gè)梯度，表示10個(gè)相 對(duì)的細(xì)菌濃度（預(yù)先用相應(yīng)的細(xì) 菌測(cè)定）。某一未知濃度的菌液在透射光下用 肉眼與某一比濁管進(jìn)行比較，如果 兩者的濁度相當(dāng)，即可目測(cè)出該菌 液的大致濃度。精確的測(cè)定，要用分光光度計(jì)進(jìn) 行。在可見(jiàn)光的450650nm波長(zhǎng) 內(nèi)測(cè)定。計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)法即是計(jì)算微生物繁殖出 的個(gè)體數(shù)目，

18、此法適宜于單細(xì) 胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物 所產(chǎn)生的孢子。直接計(jì)數(shù)法直接法即是在顯微鏡下直接觀察 細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法，其計(jì)數(shù) 結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌 數(shù)。比例計(jì)數(shù)法粗放的計(jì)數(shù)。將已知顆粒（如孢子 或紅細(xì)胞等）濃度的液體與待測(cè)細(xì) 胞濃度的菌液按一定比例均勻混 合，然后鏡檢各自的數(shù)目，求出未知菌液中的細(xì)胞濃度。血球計(jì)數(shù)板/計(jì)數(shù)一定容積中的細(xì)胞總數(shù)的常用方法應(yīng)用范圍：細(xì)胞較大的酵母菌。間接計(jì)數(shù)法 平板菌落計(jì)數(shù)法常用的細(xì)菌、單細(xì)胞真菌總數(shù)的 計(jì)數(shù)法利用在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）形成 菌落的菌落計(jì)數(shù)法（colony-counting methods）平板菌落計(jì)數(shù)法（ Plate Countingmethod概念：把稀釋好的一定量菌樣通過(guò)澆注或 涂布的方法，讓微生物單細(xì)胞一一分 散在瓊脂平板上(內(nèi))，待培養(yǎng)后， 每一個(gè)活細(xì)胞形成一個(gè)單菌落，即菌 落形成單位(c olony forming unit， cfu)