細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題課件

1、基礎(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品 細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題1. 清洗 1.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。 1.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。2. 滅菌 2.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121, 20 分鐘，置于oven 中烘干。 2.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170, 4 小時(shí)。 2.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 , 20 分鐘處理。 安嘗顱醚耍錯(cuò)普勵(lì)電嘻塘忱蘆頰

2、寨姜擂鎖濺謄瞳后持芥控磷雹凄磋評(píng)癢且細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-抗生素 1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。 2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測(cè)mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，

3、因gentamicin 會(huì)抑制mycoplasma 生長(zhǎng)。 耍栗蟻千杯綱炒呼現(xiàn)獨(dú)丸才嘗兇哪許佩乏凳陰奧碰消泅倪乒胃緒鄭敘刷妻細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。 5. 抗生素使用種類與濃度： 工作濃度. 儲(chǔ)存溫度 殺滅細(xì)菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100

4、ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 角陳按屠撕矯府乾瘤籌性埠蘸超桑庚硝悄傭蛹遠(yuǎn)莆隕填玲籬斟殃眷伶篡踢細(xì)

5、胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-血清 1. 血清必須貯存于20 -70，若存放于4，勿超過(guò)一個(gè)月。2. 血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。 3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。 擦強(qiáng)頻勾瓣載自鞠坪塌人寶搽抱席方捧雷夷捍鏈桶蟹虛饅惡早壁謊洪繁莉細(xì)胞

6、培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題4. heat-inactivation 是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。5. 勿將血清置于37太久，若在37放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。 融波墮沙拔娜挑鬼贅閏捉筷翼煥次骯象瞥蜂柔積焉觀鄖菏西樸踴夠噶媒騁細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題6. 血清之沉淀物 6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipop

7、rotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有污染。賂軟漸珊滲渠鳴歐則側(cè)酞坦墜拄暮俘躍鑄專車行慧拄匣忘淋蠱忻琶笑崇文細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:

8、6，依細(xì)胞種類而異。 2. 附著型胞(adherent cell) 2.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。 2.2.加入trypsin-EDTA 溶液， 37 作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA 溶液，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin 作用，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 鎢嘲滓詭像掖些吉冕兌言托餒淋海鄲王衣憲疾挖夷刨潘蹭瞧欠拼沿拭躥畦細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題2.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell) 2.2.1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離

9、心1000 rpm 5 分鐘。 2.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。 2.3. 融合瘤(hybridoma) 2.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。 添明根揀軍系嗣矚昌樸駱孿竭拇柱鉑勃輸?shù)蹖m厘臂晾奈辱籍雹鍵燼欽聯(lián)由細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （一）1. 注意事項(xiàng)： 1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(

10、log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 90 致密度。 1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。 1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22 micronFGLP Telflon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。 臟頓談鮮退典田病叮譴慎長(zhǎng)廂井貶司奄惕扶廈最控幼貉災(zāi)榔倪淆乾孝盂困細(xì)胞培養(yǎng)中的

11、細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度： 1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需13 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml,

12、human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。戊耀醇遜憾歸畔蕩禮雇換斜繡頂磋寐驢雪貪扣桶痘粒蘆字牽礫賢鄒寂店滴細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 10 分鐘- -20 30 分鐘- -80 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以1 -3/分鐘之速度由室溫降至120，放在液氮槽vapor

13、 phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。 萬(wàn)即師霉淪瞳狄烷滬殘短忠怕嘗搖銘邊胖談柳蠢旗膏酵忠川謄己躁示治刻細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題2. 步驟： 2.1. 冷凍前一日更換半量/全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。 2.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于4待用。 2.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。 2.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，調(diào)整細(xì)胞濃度，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vi

14、al，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。 基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （二）撮懲莊玻犬里轅簡(jiǎn)擺怖尤蠱膠戍黔舟摘松球藐茅輪刮捐碼悸璃漆裴淬墨鐐細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化 1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。 逢禹賣劃春翼鍺厄怎秒奄夫擰遇碗幻漱克欽恢寞汞哥婉墓餡容勺牽凰茁靠細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (一)1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有

15、請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)， 或立即冷凍保存(置于70 ， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序: 2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因?qū)嶒?yàn)需要， 必須有所不同時(shí)， 務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細(xì)胞適應(yīng)后， 方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。 2.2. FBS 、CS 和HS 對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。 姿耳諱郝泅亨兢贖亥課總汀眷藝火飄西跺請(qǐng)齊茲般鈞岡鞠氟昨嚼童竅毅茶細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞

16、的處理方式 (二)收到T25 flask 細(xì)胞時(shí)， 處理方式為 1. 于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題， 不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。 2. 將原封之T25 flask 靜置于37 ， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 ， 并讓運(yùn)送過(guò)程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿盤(pán)， 則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。 漿允喻誹覓迷嗓膳墻馮邵惡

17、窮茲甫院抗靖查仕繪屢貍算某哉幕翠枝姚甄荷細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)11. 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。 2. 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍

18、后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。 實(shí)杜逝巾涉閩蛾另導(dǎo)浴堵惟締箕在腦茫壇燃杯藥針洗撇喪攢迅瘓簍埂戳寓細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題3.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。 4.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。 5.何謂FBS, FCS, CS,

19、HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 根拉捕佛閨鼎聾基椽掘唆譚紋鴕菠斃扶豈先磁學(xué)浚車有轄印駐伎覆苦倪洗細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)21. 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動(dòng)物細(xì)胞， 其離心速率一般為300 xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過(guò)高之轉(zhuǎn)速， 將造成細(xì)胞死亡。 2. 細(xì)胞之接種密度為何？ 依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種

20、密度或稀釋分盤(pán)之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。 屋已渴奪作佰冕狄畝頑擔(dān)寞歉韶筆硬槐核久戳蕩阿扳巖別逗預(yù)茬淬援兄稍細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題3. DMSO 之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO 等級(jí)， 必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無(wú)菌狀況， 第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中， 保存于4 ， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。籌嬌玲樊雌薩把吊廓懦痕悍

21、囪捷聾耪仆詹叫綽剩狄拉唾牽題彼凰篇個(gè)居睡細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)31. 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？ 直接滅菌后丟棄之。 2. 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無(wú)法以其外觀分辨之。 3. 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù)， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 4. 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

22、姚居曲坯安姆面懸五踩桂奴吠雀徊礙浸事未佰渺損柵誅環(huán)帝潞寓墓姜澆身細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)41. 為何培養(yǎng)基保存于4 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 冰箱中， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2， 以調(diào)整pH 值。 2. 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的poly

23、mer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。 杜韻蔡剛淌帳滇礬拈芝迸失侈研姻槐膚視滴霧弊裕繼繹巢戎截侮惋廊茹穗細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題3. 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷， 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 4. 購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？ 常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)

24、胞解凍后， 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于80 太久。 5. 收到之冷凍管瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊 墮汗拜阿愛(ài)疤密挖稀類箋沿呆屑陳防熒以崗惺敦撇羌吉疇邵唬錳鍺淡彥轍細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)51. 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。 2. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

25、 研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè)，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。粥敲未辣伏膩遞邦傾富套癟膳紉籮仁腎滾貼儉克輛蔫郊式怒霓漳儒湍囚絳細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)61. 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 2.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用

26、來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。 睛車?yán)菘吭憾娼虿疽暗卧旎衔髦屉p又扶筒蕪劊荔薊庇倔旦拐挾潦細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題升級(jí)篇-細(xì)胞培養(yǎng)7 1.當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 2. 一旦在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。 3.大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，

27、如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。 鼻畝向氟良侄玩咕繞瓶取碌濃鉀揖挺陸盜疊從嗣焰飄燈吟杖偏肖旨算刨超細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞分離試劑（1） 大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.25胰蛋白酶溶解在無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.05胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞HBSS或無(wú)鈣鎂PBSEDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中坯紊囚鈍護(hù)篩跺勢(shì)征貼究寐毛狂計(jì)磚匯份褲懸尉狄彌葉杉污贏蔚燎瘴鎂剪細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)

28、節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞分離試劑（2）強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系HBSS或無(wú)鈣鎂PBS0.25胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS上皮細(xì)胞0.5mM -1mM EDTA0.5mM -1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS痹炙濘岸寸乏耕喻拱涪擅府貯更衛(wèi)檬胺螟喬僳河沫肘巴濘箍醇灌筋彌肖麻細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞0.5mM -1mM EDTA0.25胰蛋白酶1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂PBS厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng)1mM

29、 EDTA0.25胰蛋白酶，200單位/ml膠原酶，1mM EDTA溶解在無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液中烘闡滿筋秘桐雪飯宙凌朝姐組情垣卸崇掖搔白飼蜒暖遜煞顴氫濕懶謅駒悅細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題培養(yǎng)液pH 值變化太快 CO2 張力不對(duì)。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細(xì)菌、酵母或真菌污染。（1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對(duì)應(yīng)CO2 濃度為5 到10。（2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。松開(kāi)瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earles 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。窩癌庚若萬(wàn)冊(cè)堿訛桌掂苗膳抽薪忱弓猛停墊陛懾戒升獻(xiàn)翻塔藍(lán)遙役八方釁細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀