細(xì)胞破碎與分離設(shè)備課件

1、第六章 細(xì)胞破碎與料液分離設(shè)備細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。細(xì)胞破碎定義為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。生物類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（幾丁質(zhì)）（80-90%）脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌 破

2、碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅固；酵母 葡聚糖的細(xì)纖維構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，甘露聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；霉菌 細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高；植物細(xì)胞 次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。常用破碎方法分 類作 用 機(jī) 理適 應(yīng) 性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革

3、蘭氏陽性菌超聲破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活機(jī) 械 法進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研

4、磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Bead mill）原理：實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、 Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。膠體磨德國進(jìn)口珠磨機(jī)2.高壓勻漿法（High-pressure homogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過

5、針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用高壓勻漿器的排出閥易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。 影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過勻漿器閥的次數(shù)大、中、小型高壓勻漿器利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波

6、作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）影響超聲波的細(xì)胞破碎效率因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時間等。超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。該法在實驗室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。非 機(jī) 械 法1.酶溶法（Enzymatic Lysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶-1，3-葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方

7、法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的缺點(diǎn)：溶酶價格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點(diǎn)：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。 （2）自溶法（Autolysis）某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或

8、膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。2.化學(xué)滲透法（Chemical permeation）Triton X-100牛黃膽酸鈉十二烷基磺酸鈉（1）表面活性劑表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要是處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。（2）EDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級醇等。（3）有機(jī)溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的

9、疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。通用性差；時間長，效率低；有些化學(xué)試劑有毒 ?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。 其他方法1

10、. X-press法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。 2. 滲透壓法（Osmotic pressure）將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。 3. 反復(fù)凍結(jié)-融化法此法使細(xì)胞

11、結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。 4.干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥破碎率的測定與破碎技術(shù)的研究方向 1. 破碎率的測定直接測定法（革蘭氏染色法）目的產(chǎn)物測定法導(dǎo)電率測定法2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合定 義： 在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法稱為過濾。一、過濾固液分離設(shè)備過濾介質(zhì)無定形顆粒：無煙煤、砂、顆粒活性炭、鐵礦砂等成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料以及用合成樹脂粘結(jié)的硅砂、塑料顆粒等，做成圓筒形或板狀。非金屬織補(bǔ)棉：

12、化學(xué)纖維、玻璃纖維織品、長纖維濾布、短纖維濾布。金屬織布：不銹鋼絲或鐵絲等的織布。無紡品：紙、氈、石棉板、合成纖維無紡布等。過濾設(shè)備的分類根據(jù)推動力的不同可分為四類重力過濾自然過濾加壓過濾板框過濾真空過濾真空過濾器離心過濾離心過濾器過濾設(shè)備板框過濾機(jī)板框壓濾機(jī)由壓濾機(jī)濾板、液壓系統(tǒng)、壓濾機(jī)框、濾板傳輸系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)等五大部分組成。板框壓濾機(jī)工作運(yùn)行的原理：先由液壓施力壓緊板框組，料液由中間進(jìn)入，分布到各濾布之間，通過過濾介質(zhì)而實現(xiàn)固、液分離的脫液方法。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌（需預(yù)處理）等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。 濾板與濾框的

13、工作情況優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、裝配緊湊、過濾面積大、允許采用較大的操作壓力，輔助設(shè)備少，動力消耗小，過濾和洗滌質(zhì)量好，對固形物含量要求低，材料選擇范圍廣。缺點(diǎn)：設(shè)備笨重、占地面積多、輔助時間長、生產(chǎn)效率低。 板框過濾機(jī)在濾板的外緣有一個鈕的稱為過濾板，三個鈕的稱為洗滌板，在濾框的外緣鑄有兩個鈕。從圖8-2可以看出，1是過濾板，2是濾框，3是洗滌板。板和框是按照鈕的記號1-2-3-2-1的順序排列的。 濾板和濾框的構(gòu)造如圖所示。濾板表面上有棱狀溝槽，其邊緣略微突起。在板、框和濾布的兩個角都有小孔，它們組合并壓緊后即構(gòu)成了供濾液和洗滌水流通的孔道?？虻膬蓚?cè)覆以濾布，空框和濾布圍成了容納濾漿和濾餅的空間。

14、濾板的作用有二：一是支撐濾布；二是濾液流出的通道。 操作前，應(yīng)將板、框和濾布按前述順序排列，并轉(zhuǎn)動機(jī)頭，將板、框和濾布壓緊。操作時，懸浮液在壓力下經(jīng)懸浮液通道和濾框的暗孔進(jìn)入框內(nèi)。濾液分別穿過兩側(cè)濾布，沿板上溝槽流下，匯集于下端，經(jīng)濾液出口閥流出。然后將濾框和濾布洗凈，重新裝合，準(zhǔn)備下一次過濾操作。但是，多數(shù)情況濾餅裝滿后還需洗滌，有時還需壓縮空氣吹干。所以，板框式過濾機(jī)的一個工作周期包括裝合，過濾，洗滌（吹干），去餅，洗凈等過程。過濾和洗滌過程的情況見圖。 真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)（1）過濾區(qū) 當(dāng)浸在懸浮液內(nèi)的各扇形格同真空管路接通時，格內(nèi)為真空。在轉(zhuǎn)筒外壓力差的作用下，濾液透過濾布，被壓入扇形格內(nèi)，

15、經(jīng)分配頭被吸出。而固體顆粒在濾布上則形成一層逐漸增厚的濾渣。（2）洗滌吸干區(qū)域 當(dāng)扇形格離開懸浮液進(jìn)入此區(qū)時，格內(nèi)仍與真空管路相通。濾餅在此格內(nèi)將被洗滌并吸干，以進(jìn)一步降低濾餅中溶質(zhì)的含量。有些特殊設(shè)計的轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)上還設(shè)有繩索（或布）壓緊濾餅或用滾筒壓緊裝置，用以壓榨濾餅、降低液體含量并使濾餅厚薄均勻防止龜裂。（3）卸渣區(qū) 這個區(qū)與分配頭的室相接通，在室通入壓縮空氣，壓縮空氣促使濾餅與濾布分離，然后將濾餅清除。（4）濾布復(fù)原區(qū) 濾渣被刮落后，為了除去堵塞在濾布孔隙中的細(xì)微顆粒，壓縮空氣通過分配頭的室進(jìn)入復(fù)原區(qū)的濾室，吹落這些顆粒使濾布復(fù)原，重新開始下一循環(huán)的操作。因為轉(zhuǎn)鼓不斷旋轉(zhuǎn)，每個濾室相繼

16、通過各區(qū)即構(gòu)成了連續(xù)操作的工作循環(huán)。而且在各操作區(qū)域之間，都有不大的休止區(qū)域。優(yōu)點(diǎn)： 真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)具有自動化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大（10）的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過濾分離。缺點(diǎn)： 由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過濾，且過濾所得固相的干度不如加壓過濾。 真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)二、離 心定義： 基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。離心分離方法1.差速離心工業(yè)上最常用的離心分離方法定義：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器

17、。對象：混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀 原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。分類：1）移動區(qū)帶離心 2）等密度離心常用密度梯度物質(zhì)：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr2. 密度梯度離心多用于生化研究1）移動區(qū)帶離心用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。此法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。2）等密度離心細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該層達(dá)到平衡，從而將不同密

18、度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。 A移動區(qū)帶離心 B等密度離心離心機(jī)分類制備性離心機(jī)分析性離心機(jī)：超速離心機(jī)普通離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)實驗型離心機(jī)工業(yè)型離心機(jī)碟片式離心機(jī)是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。分離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量達(dá)到300m3/h，常用于大規(guī)模的分離過程。適用范圍 細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片管式離心機(jī)管式離心機(jī)是一種分離效率很高的離心分離設(shè)備，其轉(zhuǎn)鼓細(xì)長，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，分離因數(shù)可達(dá)104-6105。它設(shè)備簡單、操作穩(wěn)定。適用范圍 細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等。特別適合一般分離機(jī)難以分離的固形物含量30

19、0的電解質(zhì)、非電解質(zhì)都可有效的除去，其中分子量在100300之間的去除率為90以上。反滲透工業(yè)應(yīng)用包括：海水和苦咸水脫鹽制飲用水；制備醫(yī)藥、化學(xué)工業(yè)中所需的超純水；用于處理重金屬廢水用于濃縮過程，不會破壞生物活性，不會改變風(fēng)味、香味。包括：食品工業(yè)中果汁、糖、咖啡的濃縮；電鍍和印染工業(yè)中廢水的濃縮；奶品工業(yè)中牛奶的濃縮。反滲透法反滲透的分離機(jī)理反滲透中溶劑和溶質(zhì)是如何透過膜的，在膜中的遷移方式如何？ 溶解擴(kuò)散模型優(yōu)先吸附模型溶解擴(kuò)散模型適用于均勻的膜，能適合無機(jī)鹽的反滲透過程，對有機(jī)物優(yōu)先吸附毛細(xì)孔流動模型比較優(yōu)越。膜過濾裝置目前生產(chǎn)的膜過濾裝置都由膜件(Module)構(gòu)成，膜組件：有膜、固定

20、膜的支撐體、間隔物以及容納這些部件的容器構(gòu)成的一個單元。一個良好的模件應(yīng)具備下列條件：1.膜面切線方向速度快，有高剪切率，以減少濃差極化2.膜的裝載密度，即單位體積中所含膜面積比較大；3.拆洗和膜的更換比較方便，4.保留體積小，且無死角。5.具有可靠的膜支撐裝置 膜過濾裝置的型式及其適用范圍常見的膜過濾裝置有四種類型： 管式 中空纖維式 平板式 卷式（螺旋式）1) 平板式膜組件 這類膜器件的結(jié)構(gòu)與常用的板框壓濾機(jī)類似，由膜、支承板、隔板交替重疊組成。濾膜復(fù)合在剛性多孔支撐板上，料液從膜面流過時，透過液從支撐板的下部孔道中匯集排出。為減小濃差極化，濾板的表面為凸凹形，以形成湍動。濃縮液從另一孔道流出收集。優(yōu)點(diǎn): 組裝方便，膜的清洗更換容易，料液流通截面較 大，不易堵塞，同一設(shè)備可視生產(chǎn)需要組裝不同數(shù)量的膜。缺點(diǎn): 需密封的邊界線長 截留液透過液料液 膜支撐板隔板平板式膜組件平板式構(gòu)造板式膜實驗室設(shè)備圖(millipore公司)：板式反滲透(納濾)膜裝置(生產(chǎn)型) 板式膜超濾工業(yè)設(shè)備圖:2) 卷式膜組件將膜、支撐材料、膜間隔材料依次疊好，圍繞一中心管卷緊即成一個膜組。料液在膜表面通過間隔材料沿軸向流動，透過液沿螺旋形流向中心管