泛素化蛋白修飾

1、泛素化蛋白修飾 Protein Modification by Ubiquitination北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生課程：細(xì)胞信息(xnx)與調(diào)控2010年10月13日共六十六頁The Central Dogma （Revised)DNARNAProteinBreakdownModification & Degradation共六十六頁E1-E1E2-E2底物(d w)E3ATPAMP+PPiUbUbUb蛋白酶體泛素蛋白酶體通路(tngl)Ub: 泛素 (Ubiquitin)，一高度保守的，由76個(gè)氨基酸組成的多肽。E1: 泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme)，人

2、類僅有2種E1。E2: 泛素載體蛋白 (Ubiquitin-carrier protein)， 人類約有 30 種E2s。E3: 泛素蛋白連接酶 (Ubiquitin-protein ligase)， 人類有500多種E3s 。9共六十六頁 泛素化(ubiquitination)即蛋白質(zhì)被泛素(ubiquitin，由76個(gè)氨基酸組成的多肽）共價(jià)修飾的過程，在幾乎所有的真核細(xì)胞活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用。泛素 蛋白酶體(proteasome)通路則是真核細(xì)胞內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)降解途徑。泛素化調(diào)控的細(xì)胞活動(dòng)至少(zhsho)包括: 細(xì)胞周期（Cell cycle progression）細(xì)胞凋亡（Apopt

3、osis）轉(zhuǎn)錄調(diào)控（Transcriptional regulation）DNA修復(fù)（DNA repair）免疫應(yīng)答（Immune response）蛋白質(zhì)降解及質(zhì)量控制（Protein degradation and quality control )2共六十六頁The Nobel Prize in Chemistry 2004 for the discovery of ubiquitin-mediated proteolysis Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose 阿龍( ln).西查諾瓦 阿夫拉姆.赫希科 歐文.羅斯 3共六十六頁近年與泛

4、素蛋白酶體相關(guān)(xinggun)的PubMed論文數(shù)在持續(xù)增長4篇數(shù)(pin sh)年份共六十六頁本專題內(nèi)容(nirng)1. 泛素蛋白酶體通路的組成及重要性2. 泛素化與泛素化酶3. 去泛素化酶4. 泛素化異常與人類重大(zhngd)疾病的發(fā)生5. 蛋白酶體構(gòu)成6. 蛋白酶體抑制劑與藥物7. 調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的新機(jī)制8. 類泛素蛋白（SUMO, NEDD8, ISG15, APG8, APG12， PUP等）5共六十六頁中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社， 2008年 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解(jin ji)Ubiquitin-Mediated Proteolysis主編：邱小波 王琛 王琳芳參考書陳竺和諾

5、貝爾獎(jiǎng)得主(d zh)Aaron Ciechanover作序共六十六頁蛋白質(zhì)泛素化研究(ynji)簡史1975年，Goldstein誤將泛素（Ubiquitin)當(dāng)作胸腺激素而發(fā)現(xiàn)。 1977年，Goldknopf和Busch認(rèn)定組蛋白2A與泛素以異肽鍵（Isopeptide Bond）結(jié)合。 1977年，Goldberg證明人類細(xì)胞中存在一可溶的，直接依賴于能量的非溶 酶體類蛋白酶 。1978年，Ciechanover 和 Hershko發(fā)現(xiàn)了APF-1是Goldberg系統(tǒng)中蛋白酶 系的必要成分，結(jié)果發(fā)表在BBRC。1980年，Ciechanover，Hershko和Rose等人證明了AP

6、F-1與當(dāng)時(shí)已被發(fā) 現(xiàn)的泛素是同一物質(zhì) 。1984年，F(xiàn)inley和Varshavsky等發(fā)現(xiàn)泛素在細(xì)胞周期中的重要性。 1987年，Goldberg和Rechsteiner兩個(gè)小組幾乎同時(shí)分離出分子量很大的 依賴于ATP并降解(jin ji)泛素化底物的蛋白水解酶。1988年，Goldberg將這種蛋白水解酶命名為Proteasome（蛋白酶體）。1997年，Yeh 等小組發(fā)現(xiàn)類泛素蛋白SUMO和NEDD8的功能。2003年，美國FDA批準(zhǔn)了用Velcade來治療多發(fā)性骨髓瘤； Velcade 是 在Goldberg發(fā)明的蛋白酶體抑制劑MG132的基礎(chǔ)上研發(fā)而成的。2004年，Ciechan

7、over，Hershko和Rose因發(fā)現(xiàn)泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解共 同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2008年，Darwin等在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)類泛素化修飾。7共六十六頁Figure 8-34 Ubiquitin (泛素）泛素由76個(gè)氨基酸殘基組成，其中(qzhng)包括7個(gè)賴氨酸殘基(K), 其C末端可與底物的賴氨酸殘基形成異肽鍵，從而引起底物泛素化。泛素的K11、K29、K48和K63均能參與形成泛素與泛素間的異肽鍵 (Isopeptide bond)。10共六十六頁E1與ATP結(jié)合后，催化泛素羧基末端腺嘌呤化，同時(shí)釋放無機(jī)焦磷酸（PPi）。E1活化位點(diǎn)的半胱氨酸硫醇激活泛素腺嘌呤核苷酸中間產(chǎn)物上的羧基，形成一

8、個(gè)(y )泛素硫酯鍵。E2激活的重要條件是位于UBC結(jié)構(gòu)域的一個(gè)保守半胱氨酸催化位點(diǎn)與泛素羧基端形成一個(gè)硫酯鍵。E3催化被E2活化的泛素C-端甘氨酸與底物或下一個(gè)泛素的賴氨酸間形成泛素異肽鍵 (Isopeptide bond)。11共六十六頁調(diào)節(jié)(tioji)蛋白質(zhì)內(nèi)吞，修飾和轉(zhuǎn)錄靶蛋白必須(bx)經(jīng)多聚泛素(多于4個(gè)泛素分子)修飾才能被蛋白酶體識別與降解。泛素化模式（Ubiquitination Modes）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和定位K48 polyubiquitylationK63 polyubiquitylationMonoubiquitylationMultiple monoubiquit

9、ylation12共六十六頁 a. RING finger domain（SCF復(fù)合體，APC， MDM2， Parkin, 和c-Cb1） b. U-box domain（CHIP) c. HECT domain（能與底物(d w)形成硫酯鍵) d. N-End Rule E3的種類(zhngli)13共六十六頁E3泛素連接酶以單體(dn t)和復(fù)合體兩種形式存在14共六十六頁Amerik and Hochstrasser, 2004去泛素化作用(zuyng) （Deubiquitination）15共六十六頁泛素-C-末端水解酶 ，通常參與蛋白降解后泛素分子的再利用及對多聚泛素鏈的修飾(x

10、ish)，也參與由泛素前體產(chǎn)生泛素單體的過程（如UCH37、UCH-L1)。泛素特異性蛋白酶 ，參與去除蛋白質(zhì)上的多聚泛素鏈，也可從短泛素鏈的末端去掉單個(gè)泛素（如USP8)。去泛素化酶屬半胱氨酸蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)90多種。去泛素化酶可分為(fn wi)兩類：去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme)16共六十六頁泛素化途徑的異常與人類重大(zhngd)疾病神經(jīng)退行性疾病（如帕金森氏癥）：Parkin, UCH-L1癌癥: BRCA1, CYLD, Mdm2, Nrdp1, pVHL 傳染病病原體的入侵(rqn)、致病機(jī)制: E6-AP17共六十六頁泛素連接酶Parkin的失活

11、與帕金森氏癥（AR-JP)Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:38438918共六十六頁Current Opinion in Neurobiology 2004, 14:384389Parkin Substrates19共六十六頁UCH-L1為一去泛素化酶，它在帕金森氏癥病人中的突變可能導(dǎo)致其酶活性的喪失，減少了泛素自由單體(dn t)的供應(yīng)及底物蛋白的降解，進(jìn)而導(dǎo)致黑質(zhì)病變。帕金森氏癥中的去泛素化20共六十六頁失調(diào)蛋白 底物 修飾 腫瘤(zhngli)類別SKP2 p27 (KIP) Polyubiquitylation Malignant me

12、lanomaMDM2 p53 Polyubiquitylation Non-small-cell lung cancer, soft-tissue carcinoma, colorectal cancer HAUSP p53, MDM2 De-ubiquitylation Non-small-cell lung cancer lymphoma APC Cyclin B, Polyubiquitylation Colorectal cancer securin FANCL FANCD2 Monoubiquitylation Fanconi anaemia-related cancers CYLD

13、 IKK De-ubiquitylation Cylindromatosis IAP2 BCL10 Polyubiquitylation MALT lymphomas CBL RTKs Multiple Lymphoma, AML and monoubiquitylation gastric carcinoma pVHL HIFPolyubiquitinationvon Hippel-Lindau disease泛素化失調(diào)(shtio)與腫瘤21共六十六頁 1 394 470 684 956 N末端C末端 TRAF2結(jié)合位點(diǎn) CYLD具有TRAF2（TNF-receptor-associate

14、d factor 2，為 I B 的泛素連接酶) 結(jié)合(jih)位點(diǎn)，可促進(jìn) I B 的去泛素化。去泛素化酶CYLD的突變與圓柱瘤Cylindromatos的發(fā)生(fshng)相關(guān)22共六十六頁CYLD促進(jìn)(cjn)IB的去泛素化，從而抑制NF-B的活性23共六十六頁N ENGL J MED 2004, 350:187-188圓柱瘤Cylindromatos也稱 “頭帕腫瘤綜合癥”(turban tumour syndrome), 其患者細(xì)胞CYLD的兩個(gè)等位基因都發(fā)生了突變，結(jié)果(ji gu)使患者細(xì)胞中CYLD喪失功能，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-B的過度活化；啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖2

15、4共六十六頁泛素連接酶Mdm2和E6-AP與p53的降解(jin ji)和癌癥25共六十六頁Ubiquitination occurs on histones H1, H2A, H2B and H3. This modification on different histones plays distinct roles in regulation of chromatin structures, and hence gene expression and genome stabilityUbiquitination and transcriptional regulation共六十六頁Ubi

16、quitination of histone H2A and H2B has opposite effects on transcription. Ubiquitination of H2B is associated with gene activation, while H2A ubiquitination contributes to gene silencingWang et al., NATURE |VOL 431 | 14 OCTOBER 2004共六十六頁Lee et al., Cell 131, 10841096, 2007Histone Crosstalk between H

17、2B Mono-ubiquitination and H3 Methylation Mediated by COMPASSCps35 Is Required for Translating Histone Crosstalk between H2B Monoubiquitination and H3 Methylation by COMPASS共六十六頁1.Nrdp1 是一新(y xn)的含有RING finger 結(jié)構(gòu)域的泛素連接酶 。RING FingerSubstrate-Binding RegionNrdp1 是一促進(jìn)(cjn)ErbB3及BRUCE泛素化和降解的泛素連接酶2. Erb

18、B3 是表皮生長因子受體家族 (EGFR family)成員之一， 在生長，發(fā)育及細(xì)胞存活中起著關(guān)鍵的作用。該家族與許多 腫瘤密切相關(guān)，已成為癌癥治療的重要標(biāo)靶之一。3. BRUCE/Apollon 是一含有BIR domain（凋亡抑制蛋白的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域）和E2 domain 的巨型 (530 kDa) 膜蛋白BIR domainE2 (ubiquitin-carrier) domain26共六十六頁Nrdp1促進(jìn)細(xì)胞凋亡并可能與癌癥(i zhn)和帕金森氏癥相關(guān)Nrdp1ApoptoticStimuliPI3 kinaseAKT/PKBIKK abErbB3I-B PNF-Bactivat

19、ionApoptosis Caspase-3/7Pro-casp-9Caspase-9Other IAPs(e.g., c-IAP1)SmacSmacprecursorParkinBRUCE?p53Sperm Differentiation NIP 1. Qiu* & Goldberg* (2002), PNAS2. Qiu* et al. (2004), EMBO J3. Qiu* & Goldberg* (2005), J. Biol. Chem. 4. Liu, Qiu* et al. Manuscript in preparation27促進(jìn)抑制共六十六頁本專題內(nèi)容(nirng)1.

20、泛素蛋白酶體通路的組成(z chn)及重要性2. 泛素化與泛素化酶3. 去泛素化酶4. 泛素化異常與人類重大疾病的發(fā)生5. 蛋白酶體構(gòu)成6. 蛋白酶體抑制劑與藥物7. 調(diào)節(jié)蛋白酶體活性的新機(jī)制8. 類泛素蛋白28共六十六頁The Biochemical Roles of Protein Degradation in a Cell1. 溶酶體 (Lysosomes)Non-selective Hydrolyze proteins from autophagy Digest proteins from endocytosis Membrane proteins Extracellular prot

21、eins 2. 泛素-蛋白酶體通路(tngl)Selective and (Ubiquitin-Proteasome Pathway)ATP-Dependent Regulate biochemical reactions Discard unnecessary proteins Degrade damaged or misfolded proteins Present internalized antigens in immunological responses29共六十六頁 20S 催化(cu hu)顆粒 19S調(diào)節(jié)(tioji)顆粒19S10 nm電鏡下的26S蛋白酶體(Proteas

22、ome)Yifan Cheng, Xiao-Bo Qiu et al., unpublished data30共六十六頁26S 蛋白酶體的亞基組成(z chn)31共六十六頁32共六十六頁免疫(miny)蛋白酶體(Immunoproteasome)負(fù)責(zé)抗原提呈(Antigen Presentation)免疫蛋白酶體的催化顆粒(kl)(20S) 有三個(gè)特殊亞單位LMP2、LMP7 和MECL-1。其調(diào)節(jié)顆粒為PA28（11S）。20S顆粒33共六十六頁MHC class I antigen presentation pathwayT cellPeptideMHC class IProtein a

23、ntigenProteasome+/- UbiquitinPeptides (2-24 a.a.)TAP (8-16 a.a.)Endoplasmic ReticulumCD8+Golgi8-10 a.a.Amino acidsERAP134共六十六頁35共六十六頁The proteasome inhibitor, Velcade (Botezomib/PS-341), has been approved by FDA to treat multiple myeloma and mantle cell lymphoma .36共六十六頁中藥雷公藤中的抗癌活性成分雷公藤紅素Celastrol是一

24、種(y zhn)蛋白酶體抑制劑，它能通過控制癌細(xì)胞的蛋白酶體活性進(jìn)而誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡。 Yang, H. et al., Cancer Res. (2006) 37共六十六頁1、 蛋白酶體亞單位hRpn13能激活存在于蛋白酶 體的去泛素化酶UCH37。2、 c-Abl通過引起(ynq)蛋白酶體磷酸化而抑制其活性。蛋白酶體的調(diào)控(dio kn)38共六十六頁hRpn13能激活(j hu)去泛素化酶UCH37control+hRpn13S5a+hRpn13+Ub-HQiu, X.B. * et al., EMBO J. （2006） 25:5742-5753. 39共六十六頁其它研究表明Rpn13可

25、作為(zuwi)泛素受體而結(jié)合于泛素鏈的近端Husnjak et al. Nature 453:481, 2008Schrener et al. Nature 453:548, 200841共六十六頁c-Abl通過引起(ynq)蛋白酶體磷酸化而抑制其活性Liu, X., Huang, W., Li., C., Li, P., Yuan, J., Li, X., Qiu, X.B., Ma, Q., and Cao, C.(2006). Molecular Cell. 22, 317-327. 42共六十六頁The 26S proteasome is a multisubunit complex

26、, consisting of the 20S catalytic particle and the 19S regulatory particle, and selectively degrades ubiquitinated proteins in the presence of ATP. Proteasomes are responsible for degradation of most cellular proteins, while lysosomes degrade extracellular proteins and most membrane proteins.Upon im

27、mune responses, cells generate special types of proteasomes, immunoproteasomes, which possess distinct regulatory particle (11S ) and catalytic particle (with different catalytic subunits), for more efficient antigen presentation. Proteasomes are responsible for degradation of most cellular proteins

28、共六十六頁本專題內(nèi)容(nirng)1. 泛素蛋白酶體通路的組成及重要性2. 泛素化與泛素化酶3. 去泛素化酶4. 泛素化異常與人類重大疾病的發(fā)生5. 蛋白酶體構(gòu)成6. 蛋白酶體抑制劑與藥物7. 調(diào)節(jié)(tioji)蛋白酶體活性的新機(jī)制8. 類泛素蛋白（SUMO, NEDD8, ISG15, ATG8, PUP等）43共六十六頁類泛素蛋白(dnbi)及其同源性44共六十六頁Ubiquitin-Like Protein Involved in the Proteasome Pathway of Mycobacterium tuberculosis Pearce et al. (2008) Scien

29、ce 322:1104PUP-conjugation is found remarkably in mycobacteria and allied actinobacterias, and is sporadically present in other lineages, such as verrucomicrobia, nitrospirae, deltaproteobacteria and planctomycetes.Iyer et al. (2008 ) Biology Direct, 3:45Protein modification by ubiquitin-like protei

30、n, PUP, in prokaryotes共六十六頁P(yáng)UP is predicted to encode a 64amino acid protein with a molecular size of 6.9 kD共六十六頁類泛素蛋白(dnbi)的結(jié)構(gòu)高度相似UbiquitinISG15SumoNEDD845共六十六頁Activating enzyme complex has two subunitsAOS1 is similar to the N-terminal half of Ub E1UBA2 is homologous to the C-terminal half of Ub E1

31、 and contains the cysteine necessary for linkage with SUMOConjugating enzyme: UBC9SUMO (Small ubiquitin-like modifier) 101 amino acids46共六十六頁SUMO修飾(xish)的功能47共六十六頁SUMO化修飾(xish)的底物48共六十六頁Desumoylating enzymesUlp1Has both isopeptidase and C-terminal hydrolase activityRequired for G2/M transitionSumo C

32、-terminal hydrolases, e.g. SENP149共六十六頁Nedd8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated) -81 residuesActivating enzyme complex (2 subunits) -APP-BP1 and UBA3The APP-BP1 N-terminal half is homologous to the N-terminal half of ubiquitin E1UBA3 is homologous to the C-terminal half o

33、f ubiquitin E1 and contains the cysteine required for thiol ester linkage with Nedd8Conjugating enzyme: UBC1250共六十六頁Function of NeddylationSubstrates (SCF components)Cdc53 in yeastCullin family members in humans51共六十六頁Crystal structure52共六十六頁Deneddylation: COP9 Signalosome (CSN)500 kDa protein compl

34、ex8 distinct subunitsCSN5/Jab1 is catalytic component of isopeptidaseHomology to subunits of the proteasome (CSN5=RPN11)53共六十六頁Other NEDD8-specific hydrolases and isopeptidasesUCH-L3 has NEDD8 C-terminal hydrolase activityUSP21 deconjugates ubiquitin and deneddylates from NEDD8 conjugates54共六十六頁ISG1

35、5 (Interferon-stimulated gene 15)Induced by interferon, lipopolysaccharides, or upon viral infectionsE1 (ISG15 activating enzyme)UBP43, ISG15-specific isopeptidase Modified proteins: JAK-STAT proteins55共六十六頁Aut7/Apg8/ATG8 in AutophagyAut7 /Apg8 is necessary for formation of membrane structures in autophagosomesSubstrate: Phosphatidylethanolamine(a phospholipid)56共六十六頁Aut7/Apg8/ATG8 and Apg12/ATG12 in AutophagyAut7=Apg857共六十六頁 Deregulated Substrate Modification Tumour type/disease SENP1 De-su