森林植物檢疫檢驗(yàn)

1、第五章 森林(snln)植物檢疫檢驗(yàn)森林植物檢驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)室 樣品和取樣昆蟲、螨類和雜草種子的檢疫檢驗(yàn)植物病原真菌的檢疫檢驗(yàn)植物病原細(xì)菌的檢疫檢驗(yàn)植物病毒(bngd)和植原體的檢驗(yàn)檢疫植物線蟲的檢驗(yàn)檢疫植物檢疫新技術(shù)復(fù)習(xí)思考題共四十一頁檢驗(yàn)技術(shù)應(yīng)符合以下基本要求：靈敏度高，準(zhǔn)確可靠(kko)，能檢出低量有害生物；簡單、快速、方便易行；要有標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)程，檢驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好；安全，不會造成有害生物的擴(kuò)散。共四十一頁一、森林植物檢驗(yàn)(jinyn)檢測實(shí)驗(yàn)室國家級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；區(qū)域性中心(zhngxn)實(shí)驗(yàn)室；常規(guī)實(shí)驗(yàn)室建筑條件檢疫實(shí)驗(yàn)室（檢驗(yàn)室）-病、蟲、草標(biāo)本室預(yù)處理室消毒處理室人員條件林學(xué)、森林保

2、護(hù)或相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域高級技術(shù)人才或復(fù)合型專業(yè)技術(shù)人才共四十一頁儀器設(shè)備條件國家級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備顯微成像系統(tǒng)、酶聯(lián)檢測儀等儀器設(shè)備-快速反應(yīng)和應(yīng)急能力地區(qū)性中心實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備顯微鏡、解剖鏡、普通冰箱、水浴箱（或溫箱）、離心機(jī)和必要的攝像器材、消毒和污物處理等設(shè)備常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備病、蟲、雜草檢驗(yàn)所需的基本設(shè)備，如放大鏡、解剖鏡、無菌操作臺等實(shí)驗(yàn)室管理(gunl)資質(zhì)(zzh)認(rèn)定證書的有效期為3年。國家級實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)認(rèn)定，由國家認(rèn)監(jiān)委負(fù)責(zé)實(shí)施；地方級實(shí)驗(yàn)室的資質(zhì)認(rèn)定，由地方質(zhì)檢部門負(fù)責(zé)實(shí)施。共四十一頁二、樣品(yngpn)和取樣樣品管理制度抽取檢驗(yàn)樣品要給報(bào)檢人簽發(fā)采樣憑證。在檢疫過程中發(fā)現(xiàn)檢疫性有害

3、生物和其它危險(xiǎn)性病、蟲的，必須保存樣品，保存期至少3個月。對不易長期保存的樣品，可根據(jù)具體情況縮短時間。樣品要制成標(biāo)本保存。標(biāo)本要注明寄主、調(diào)入（出）地和發(fā)現(xiàn)時間；不易制成標(biāo)本的被害狀及現(xiàn)場，可攝制照片(zhopin)、錄像片等存檔備查。樣品要有專人負(fù)責(zé)管理，保存期間要注意防潮、防蟲，以免受損變質(zhì)。根據(jù)樣品種類登記造冊，列明報(bào)檢單位、貨物名稱、樣品數(shù)量、取樣時間、存放起止日期、檢疫結(jié)果和最后處理意見。共四十一頁取樣應(yīng)施檢疫的森林植物及其產(chǎn)品包括：（1）林木種子、苗木和其它繁殖材料；（2）喬木、灌木、竹子等森林植物；（3）從疫情發(fā)生縣運(yùn)出的木材、竹材、根樁、枝條、樹皮、藤條及其制品；（4）森林植

4、物的種子、苗木、接穗，以及用疫區(qū)木材、種子、苗木等為原材料制成的林產(chǎn)品；（5）花卉植物的種子、苗木、球莖、鱗莖(ln jn)、鮮切花、插花；（6）中藥材；（7）可能被林業(yè)檢疫性有害生物污染的其它林產(chǎn)品、包裝材料和運(yùn)輸工具。共四十一頁三、昆蟲、螨類和雜草種子的檢驗(yàn)(jinyn)檢疫（一）昆蟲的檢驗(yàn)1.直接檢驗(yàn)2.過篩檢驗(yàn)篩選時間：手動篩選，左右擺動20次；在篩選振蕩器上0.5 min。害蟲含量（頭/kg）= 樣品中害蟲頭數(shù)（或卵粒數(shù)）/代表樣品重量（g）1 000凍僵或休眠：害蟲置于20-30 溫箱內(nèi)處理15-20 min3.隱蔽害蟲的檢驗(yàn)A染色檢驗(yàn)-谷象、米象(m xin)、豆象類紫穗槐種子1

5、0 g放入銅紗網(wǎng)中，浸入1 %碘酒溶液中染色1-1.5 min，取出后移入0.5 %氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液中處理30 s，然后用清水沖洗20-30 s，倒入白瓷盤用擴(kuò)大鏡仔細(xì)檢查，凡在靠近種托處有一個直徑1-2 mm黑色圓點(diǎn)的種粒，即為蟲蛀的種粒共四十一頁B比重檢驗(yàn)-種實(shí)含蟲率較低；線蟲蟲癭、菌核和雜草籽食鹽水、硝酸銨溶液種子與溶液的容積比以1:5為宜滯留時間：一般的1min，落葉松種子小蜂，10hC解剖檢驗(yàn)D軟X光機(jī)檢驗(yàn)-稀有、珍貴種苗的檢驗(yàn)檢疫在暗室首先把放大紙或黑白文件反拍膠片按照需要的尺寸切好，裝入黑紙袋中并做好標(biāo)記，再把被檢的種苗樣品放在黑紙袋（放大紙或膠片的正面）上，置于國產(chǎn)HY-

6、35型或其它型號農(nóng)用軟X光機(jī)載物臺上，調(diào)好焦距，打開電源，調(diào)好電壓、電流和曝光時間，開機(jī)拍攝。在暗室把放大紙或膠片取出，用顯影液顯影，用酸性定影液定影，最后根據(jù)(gnj)照片上的害蟲影像進(jìn)行識別。種殼種仁連成一體呈白色者為健康飽滿的種子；種殼輪廓清晰，種殼內(nèi)呈暗灰色者為空粒種子；種殼輪廓清晰，種殼內(nèi)暗灰色，在暗灰色的中央有一個白色幼蟲影像者為被害種子；在種殼內(nèi)暗灰色的中央有幾個白色幼蟲影像重疊在一起者為寄生性天敵的幼蟲。共四十一頁E誘器檢驗(yàn)-產(chǎn)地、港口、貨場等地誘捕器由誘集劑、誘芯和收捕器三部分組成。目前應(yīng)用的誘集劑主要有信息(xnx)素和誘餌兩類。誘芯是誘集劑的負(fù)載材料，由塑料、橡膠、脫脂棉

7、、海綿等材料制成。誘捕器的種類很多，常用的有船形、三角形、圓筒形等。共四十一頁（二）螨類檢驗(yàn)(jinyn)怕干、畏熱、負(fù)趨光性1.分樣器電熱加溫檢驗(yàn)：厚度5mm左右，43-45，30min，盤下玻璃板上的螨類2.漂浮法快速分離檢驗(yàn)共四十一頁（三）雜草種子檢驗(yàn)1.果實(shí)與種子外部形態(tài)鑒定(jindng)2.解剖鑒定3.幼苗鑒定 共四十一頁四、植物病原真菌(zhnjn)的檢驗(yàn)檢疫直接檢驗(yàn)染色檢驗(yàn)洗滌檢驗(yàn)保濕萌芽檢驗(yàn)分離培養(yǎng)檢驗(yàn)種子分部透明(tumng)生長檢驗(yàn)共四十一頁1.直接(zhji)檢驗(yàn)適用范圍：具明顯癥狀的植物材料主要工具：放大鏡或解剖鏡，主要是利用(lyng)肉眼現(xiàn)場快速初檢2.染色檢驗(yàn)法

8、原理：染病的組織，或病原菌本身，經(jīng)特殊的化學(xué)藥品處理后，可帶有特殊的顏色例如：馬鈴薯癌腫病（Synchytrium endobioticum）薯塊上癌瘤不明顯時，可做徒手切片，加1滴1的“藏花紅”染色液，健康組織細(xì)胞壁呈亮紅色，感病組織細(xì)胞壁呈暗紅色。共四十一頁3.洗滌(xd)檢驗(yàn)法原理：種子表面常附著真菌孢子，將一定量的樣品放入容器內(nèi)，加一定量的無菌水，充分振蕩，可使病菌孢子洗滌下來，而后離心后，可沉淀，鏡檢沉淀物可確定其種類和數(shù)量。主要儀器和試劑：振蕩器、離心機(jī)、顯微鏡、0.1吐溫溶液等主要試驗(yàn)流程(lichng)如下：共四十一頁稱取樣品洗脫孢子（振蕩）離心富集鏡檢計(jì)數(shù)1:1或1:2；振蕩

9、(zhndng)5-10 min以2500-3000r/min低速(d s)離心10-15 minA視野推算法B血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定法孢子生活力測定共四十一頁取一份樣品（約100?；? g），按上述步驟所得的沉淀物，用0.5 ml蒸餾水懸浮后，用吸管吸取1滴懸浮液放在載玻片上。鏡檢至少觀察5個玻片，每個玻片上檢查10個視野的孢子數(shù)量，求出每個視野的平均孢子數(shù)。同時，算出每一視野的面積及整個蓋玻片的面積，以及(yj)全玻片的視野數(shù)。再以視野數(shù)乘以每一視野上平均孢子數(shù)，再乘以0.5 ml水的滴數(shù)，即得100粒種子或5 g樣品中的孢子總數(shù)，算出每粒種子或每克種子的帶菌量。共四十一頁影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素：種

10、子表面的病菌孢子不一定能完全洗滌下來；離心管內(nèi)，懸浮液表面常形成一層極難沉降的孢子薄膜，管壁上也可能黏附孢子；將懸浮液滴于玻片時，由于孢子迅速沉淀，造成一些視野間孢子分布極不均勻；操作不夠嚴(yán)格，造成人為(rnwi)誤差。共四十一頁4.保濕萌芽(mngy)檢驗(yàn)原理：種子攜帶的真菌，無論外表黏附的還是潛伏種子內(nèi)的，在種子萌發(fā)階段即可開始(kish)侵染，甚至有些在種子還未萌發(fā)時就可長出病菌。主要儀器及試劑：吸水紙、沙土、冰箱、培養(yǎng)箱等。主要包括：保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)、沙土萌芽和土內(nèi)萌芽檢驗(yàn)等三種方法，其中保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)法是國內(nèi)外最常用的一種方法。共四十一頁吸水紙法-種傳半知菌無菌吸水紙（3層）滅菌(mi j

11、n)培養(yǎng)皿 吸水11.5cm培養(yǎng)(piyng)、觀察12h光照黑暗交替恒溫所觀察到的結(jié)果示意圖如下共四十一頁共四十一頁5.分離(fnl)培養(yǎng)檢測常規(guī)(chnggu)植物病理學(xué)方法馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（OMA）常用接種方法:拌種接種;浸種接種;花期接種；整株噴霧接種共四十一頁6.種子分部(fn b)透明檢驗(yàn)用化學(xué)方法或機(jī)械剝離方法分解種子，分別收集需要檢查的胚或種皮等部位(bwi)，經(jīng)脫水和組織透明處理后，鏡檢菌絲體和卵孢子。以檢測大麥種子傳帶的散黑穗病菌為例，其操作過程如下：先將種子在加有錐蟲藍(lán)的5氫氧化鈉溶液中浸泡22h，然后用60

12、-65的熱水沖擊或小心攪動，使種胚分離，并用孔徑分別為3.5 mm、2.0 mm和1.0 mm三層套篩收集種胚。種胚用95乙醇脫水2 min，再轉(zhuǎn)移到裝有乳酸酚和水（3:1）混合液的漏斗中，胚漂浮在上部，夾雜的種子殘屑沉在底部并通過連在漏斗下端的膠管排出。純凈的種胚用乳酸酚煮沸透明2 min，冷卻后用實(shí)體顯微鏡檢查并計(jì)數(shù)含有散黑穗菌菌絲體的種胚，計(jì)算帶菌率。共四十一頁7.生長(shngzhng)檢驗(yàn)植物繁殖材料的入境后隔離檢疫。供試材料種植在經(jīng)過高壓蒸汽滅菌處理或干熱滅菌的土壤、沙礫、石英砂或各種人工基質(zhì)中，在隔離場所和適宜(shy)條件下栽培，根據(jù)幼苗和成株的癥狀鑒定。共四十一頁五、植物(z

13、hw)病原真菌的檢驗(yàn)檢疫1.直接檢驗(yàn)(jinyn)2.分離培養(yǎng)法3.噬菌體檢驗(yàn)4.生理生化測定5.致病性測定6.過敏性反應(yīng)測定7.血清學(xué)檢驗(yàn)8.免疫吸附分離法共四十一頁共四十一頁2.分離(fnl)培養(yǎng)法種傳細(xì)菌的提取浸種法；干磨法；濕磨法提取前注意選擇已病變的種子，以0.1 升汞水進(jìn)行表面消毒1-2 min，用滅菌水洗滌，再將此種子放于70 酒精中浸幾分鐘，然后放入盛有滅菌水的三角瓶中搖蕩洗滌2-3次。塊莖、塊根細(xì)菌的分離在病健組織交界處割取較大的一塊組織，用0.1 升汞水消毒1 min，然后用滅菌水沖洗3次，用滅過菌的刀挑取一小塊組織（約(0.50.5l) mm3），放在預(yù)先(yxin)準(zhǔn)備

14、的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)的無菌水（約5 ml）中充分磨碎、攪勻，然后用鉑圈取一環(huán)菌液，移入第二個培養(yǎng)皿內(nèi)，攪勻。按此法順序移至第五個滅菌培養(yǎng)皿中，從該皿中挑取菌液進(jìn)行劃線分離。共四十一頁3.噬菌體檢驗(yàn)(jinyn)增殖法 加入已知的?；删w，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)增殖，判斷是否存在相對應(yīng)的病原細(xì)菌。間接法 測定種子是否存在目標(biāo)噬菌體，從而間接證明(zhngmng)是否帶菌，此法較常用。共四十一頁4.生理(shngl)生化測定將培養(yǎng)的細(xì)菌接種于特定(tdng)的培養(yǎng)基或檢測管，通過產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、顏色變化等反應(yīng)，或通過檢測細(xì)菌的耐鹽性、好氧或厭氧性、對碳、氮等化合物的利用和分解能力等進(jìn)行鑒別。Biolog細(xì)菌自

15、動化鑒定系統(tǒng)是美國研制的一種專門用于細(xì)菌鑒定的專家系統(tǒng)，目前應(yīng)用3.70數(shù)據(jù)庫軟件可鑒定567種革蘭氏陰性菌（G-）和256種革蘭氏陽性菌（G+）。共四十一頁6.過敏性反應(yīng)(fnyng)測定煙草是最常用的測定植物。注射針頭由煙草葉片背面主脈附近插入表皮下，注入菌懸液。若為致病細(xì)菌，1-2d后，注射部位(bwi)變?yōu)楹稚^敏性壞死斑塊，葉組織變薄變褐，具黑褐色邊緣。共四十一頁7.血清學(xué)檢驗(yàn)(jinyn)最常用的血清學(xué)方法有免疫電泳和免疫電鏡、瓊脂雙擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法還有：瓊脂擴(kuò)散法、試管沉淀法、凝集反應(yīng)法、微量沉淀法等。應(yīng)用最普遍的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(shyn

16、)（ELISA）和免疫熒光抗體法。共四十一頁酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(shyn)（ELISA）共四十一頁直接酶聯(lián)法 先將待測抗原置于微量反應(yīng)板凹孔中培育，在吸附抗原后洗滌，保留吸附孔壁的抗原，隨后加入特異性酶標(biāo)記抗體，經(jīng)洗滌后保留與抗原相結(jié)合的酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物，再加酶的底物形成有色產(chǎn)物，用肉眼定性判斷或用分光光度計(jì)定量測定。間接酶聯(lián)法 利用抗家兔或雞球蛋白的山羊抗體與酶結(jié)合制備的酶標(biāo)記抗體，只要制備出抗原的家兔特異抗血清，不需要再制備酶標(biāo)記抗體就可用以檢出抗原。國內(nèi)多用辣根過氧化物酶標(biāo)記。操作時先將待測抗原吸附于微量反應(yīng)板孔壁上，培育一定時間(shjin)后洗滌，加入特異性抗血清，經(jīng)培育和

17、洗滌后再加入羊抗兔酶標(biāo)抗體，最后加入酶的底物，并及時觀察結(jié)果。共四十一頁8.免疫吸附分離法常用的免疫吸附分離(fnl)有：平皿免疫吸附評價測定法（petri dish immunosorption evaluation test）和免疫吸附稀釋培養(yǎng)法（immunosorbent dilution plating，簡稱IDP）兩種。共四十一頁a用溶入丙酮的硝酸纖維素或指甲油包被L形玻棒b用包被緩沖液（0.05 mol/ L碳酸緩沖液，pH 9.6）稀釋抗血清，將包被有指甲油的玻棒放在抗血清中孵育，27 孵育1 h或于4 過夜。設(shè)置對照：正常血清和包被緩沖液。c用RT緩沖液（NaCl:2.0 g，

18、KCl:0.05 g，CaCl2:0.05 g，NaHCO3:0.25 g，KH2PO4:1.25 g，吐溫20:1.00 ml，蒸餾水:1 000 ml，PH 7.4）淋洗玻棒3次，每次1 mind用RT緩沖液配置所測樣品懸浮液，在樣品液中，將包被有抗體的玻棒于27 下孵育1 h或4 過夜，以吸附目標(biāo)細(xì)菌e將玻棒垂直放置，在包被有抗體區(qū)域上方2 cm處，用RT緩沖液輕輕滴洗玻棒f營養(yǎng)瓊脂表面劃線(hu xin)后培養(yǎng)，觀察菌落。共四十一頁六、植物(zhw)病毒和植原體的檢驗(yàn)檢疫1.生物學(xué)檢測技術(shù)(jsh)a直接檢驗(yàn)b生長檢驗(yàn)c指示植物鑒定2.血清學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)3.物理方法檢測a病毒形態(tài)的透射電鏡

19、觀察b熒光染色顯微檢驗(yàn)法4.分子生物學(xué)檢測方法a分子雜交檢測b聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測（PCR）5.植原體的檢測自1985年首次制備了翠菊黃化植原體單克隆抗體以來，已有4種植原體單克隆抗體制備成功。核酸雜交和PCR方法是植原體快速、高效的分子檢測和鑒定方法。共四十一頁七、植物線蟲的檢驗(yàn)(jinyn)檢疫1.直接檢驗(yàn)適合檢驗(yàn)植物組織內(nèi)生活的線蟲2.染色檢驗(yàn)適于檢驗(yàn)植物組織中的內(nèi)寄生線蟲燒杯中加入酸性品紅乳酸酚溶液(rngy)，加熱至沸騰，加入洗凈的植物材料，透明染色1-3 min后取出用冷水沖洗，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，加入乳酸酚溶液褪色，用解剖鏡檢查植物組織中有無染成紅色的線蟲。3.分離檢驗(yàn)a改良貝爾曼

20、漏斗法基本裝置是一個直徑適當(dāng)?shù)穆┒?，漏斗頸末端接一段乳膠管，用彈簧夾把管子夾住。b過篩檢驗(yàn)法c漂浮分離法d浸泡浮力離心法共四十一頁b過篩(u shi)檢驗(yàn)法用于從大量土壤中分離各類線蟲。土壤樣品置于盆中，加入2-3倍的冷水，攪拌土壤并振碎土塊過20目篩，土壤懸浮液流入第二個盆中并噴水洗滌篩上物，棄去第一個盆中和篩上的剩余物，第二個盆中的土壤懸浮液經(jīng)l min沉淀按上法過150目篩，從篩子背面將篩中物沖洗到燒杯中盆中土壤懸浮液再繼續(xù)(jx)過325目和500目篩。篩中物收集在燒杯中靜置20-30 min，線蟲沉集底部，棄去上清液，將沉集物轉(zhuǎn)移到玻皿內(nèi)鏡檢或吸取線蟲鑒定。共四十一頁c漂浮(pio f)分離法利用干燥的線蟲胞囊能漂浮在水面的特性，分離土壤中的馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）和胞囊線蟲，裝置為芬威克罐。使用時先將漂浮筒注滿水，并打濕16目篩和60目篩。風(fēng)干的土壤經(jīng)6 mm篩過篩并充分混勻后取200 g土樣，放在16目篩內(nèi)用水流(shuli)沖洗胞囊和草屑漂在水面并溢出，經(jīng)簸箕狀