高效液相色譜HLPC課件

1、高效液相色譜 （high performance liquid chromatography,HPLC）中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系 徐克前第1頁，共46頁。一基本原理（一）定義HPLC 是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同，進(jìn)行連續(xù)的、無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。 組成： 固定相柱內(nèi)填料 流動相洗脫劑第2頁，共46頁。第3頁，共46頁。（二）固定相（stationary phase)和 流動相（mobile phase）(1)化學(xué)鍵合相硅膠化學(xué)官能團(tuán)鍵合到硅膠表面 OH OH | |硅膠（SiO2 nH2O） Si O Si | |第4頁，共46頁。鍵合相反應(yīng) R1

2、| | | | Si OH + XSiR Si OSiR + HX | | | | R2 硅膠 有機(jī)硅烷 鍵合相X: Cl、CH3O、C2H5O等R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等R1 R2: Z、CH3等第5頁，共46頁。(2)十八烷基硅烷鍵合硅膠填充料（octadecylsilyl, ODS）萬能柱 即C18柱或ODS柱 主要用于反相HPLC中，適用于各種類型的生物分子第6頁，共46頁。 (3) 短鏈烷基鍵合物 短鏈烷基（c3、 c4等）大孔硅膠 鍵合物 適用于氨基酸、小肽等生物小分子第7頁，共46頁。(4)鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)性質(zhì)反相柱：填料

3、是非極性的，官能團(tuán)為烷烴，如 C18 、C8 、C4等正相柱：填料是極性的，官能團(tuán)為CN、NH2等離子交換鍵合相：陽離子官能團(tuán)：SO3H、COOH等陰離子官能團(tuán)NH2、 R4N+等第8頁，共46頁。2、流動相 （mobilephase）流動相選擇原則：1.樣品易污，且溶解度盡可能大2.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱3.不妨礙檢測器檢測分析4.粘度低，流動性好5.易于從中回收樣品6.無毒或低毒，易于操作7.易于制成高純度，即色譜純8.廢液易處理，不污染環(huán)境第9頁，共46頁。反相色譜常用流動相及沖洗強(qiáng)度H2O甲醇乙腈乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃最常用組成：甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脫順序：極性物先洗脫下來正相

4、色譜常用流動相及沖洗強(qiáng)度正乙烷乙醚乙酸乙酯異丙醇第10頁，共46頁。二、分離模式正相HPLC反相HPLC離子交換HPLC凝膠HPLC親和HPLC第11頁，共46頁。（一）正相HPLC（normal phase HPLC ,NP- HPLC ）固定相：極性吸附劑（或極性鍵合相），如硅膠、Al3O2 流動相：非極性或弱極性溶劑，如己烷、庚烷等洗脫順序：非極性、弱極性、極性 應(yīng)用：石油化工產(chǎn)品、染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有機(jī)酸、有機(jī)堿等第12頁，共46頁。（二）反相HPLC（reverse phase HPLC ,RP- HPLC ）固定相：非極性物質(zhì)，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、

5、C2 流動相：極性溶劑，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等洗脫順序：極性、弱極性、非極性 應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽等第13頁，共46頁。（三）離子交換HPLC（ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ）原理：用離子交換劑作固定相，根據(jù)不同組分在一定pH下，組分電荷性質(zhì)和數(shù)量不同而分離的技術(shù)分類：陽離子交換樹脂：含酸性基團(tuán)： 陰離子交換樹脂：磺酸基、磷酸基等合堿性基團(tuán)：季胺基、叔胺基等應(yīng)用：核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等第14頁，共46頁。（四）凝膠HPLC（gel HPLC ,G- HPLC ）原理：基于分子大小和形狀的差異進(jìn)行分析的技術(shù)固定相：交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠流動相：水、乙醇、丙酮等

6、應(yīng)用：核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖等第15頁，共46頁。（五）親和HPLC（affinity HPLC ,AF- HPLC ）原理：利用生物大分子間專一的親和力進(jìn)行分離的技術(shù)固定相：基質(zhì)（瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)配基（親和性）應(yīng)用：酶、抗體、抗原、受體等第16頁，共46頁。三、 HPLC儀器 HPLC儀 一般由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)等幾部分組成第17頁，共46頁。第18頁，共46頁。第19頁，共46頁。（一）輸液系統(tǒng)：貯液及脫氣裝置梯度洗脫裝置高壓輸液泵第20頁，共46頁。梯度洗脫裝置第21頁，共46頁。第22頁，共46頁。高壓輸液泵第23頁，共46頁。第24頁，共

7、46頁。（二）進(jìn)樣系統(tǒng)：第25頁，共46頁。（三）柱系統(tǒng)：第26頁，共46頁。（四）檢測器：與泵、柱組成HPLC的三大關(guān)鍵部件第27頁，共46頁。1.紫外吸收檢測器第28頁，共46頁。第29頁，共46頁。第30頁，共46頁。2.熒光檢測器第31頁，共46頁。4.示差折光檢測器第32頁，共46頁。第33頁，共46頁。第34頁，共46頁。表.HLPC常用檢測器檢測器 原理 檢測下限（g/ml） 檢測范圍 紫外檢測器 具有紫外吸收性質(zhì) 10-7熒光檢測器 具有熒光物質(zhì) 10-14電化學(xué)檢測器 具有電解活性物質(zhì) 10-12示差折光檢測器 與流動相折光率不同 10-7 糖類等蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、

8、激素等多環(huán)芳烴、氨基酸、維生素等食品、環(huán)境、生化、醫(yī)學(xué)等第35頁，共46頁。（五）不同HPLC產(chǎn)品介紹：高效液相色譜儀器（）第36頁，共46頁。高效液相色譜儀器（2）第37頁，共46頁。高效液相色譜儀器（3）第38頁，共46頁。高效液相色譜儀器（4）第39頁，共46頁。四、定性和定量定性分析保留值定性：比較未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物的保留值收集未知峰洗脫液定性：物理分析，化學(xué)分析，生物學(xué)分析聯(lián)機(jī)定性：液質(zhì)聯(lián)用（）液紅聯(lián)用（）第40頁，共46頁。定量分析分析檢測物質(zhì)的量（或濃度）與檢測器的響應(yīng)值（峰面積或峰高）呈正比1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：也稱外標(biāo)法或直接比較法。用標(biāo)準(zhǔn)品等體積直接進(jìn)樣，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用待測樣品的峰面積（或峰高）與其對照2.內(nèi)標(biāo)法：選擇適宜的物質(zhì)作為欲測組分的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，