活體動物光學成像系統(tǒng)在活體熒光成像中的應用

1、活體動物光學成像系統(tǒng)在活體熒光成像中的應用 第一部分技術原理一、技術簡介隨著活體動物光學成像技術在國內外的普及和應用，越來越多的科研人員希望能通過該技術 來觀察活體動物體內腫瘤細胞的生長以及對藥物治療的反應，希望能觀察到熒光標記的多 肽、抗體、小分子藥物在體內的分布和代謝情況NightOWL IILB 983 NC320活體動物光學 成像系統(tǒng)正是為滿足這樣的應用需求而設計的。該系統(tǒng)通過熒光光路的特殊設計，實現(xiàn)了對 激發(fā)光的能量控制和調節(jié)，提高了活體熒光成像的穩(wěn)定性和靈敏度，并且該系統(tǒng)操作簡單、 費用低廉、不涉及放射性，是不錯的進行活體熒光成像的儀器。與傳統(tǒng)技術相比，活體熒光 成像技術不需要殺死

2、動物，可以對同一個動物進行長時間反復跟蹤成像，既可以提高數據的 可比性，避免個體差異對試驗結果的影響。更重要的是，該技術可以得到直觀的成像圖片， 了解標記物在動物體內的分布和代謝情況，避免了傳統(tǒng)的體外實驗方法的諸多缺點，特別是 在藥物制劑學、藥物臨床前研究中有不可估量的應用前景。NightOWL IILB 983 NC320活體熒光體內成像技術的基本原理是激發(fā)光源通過特殊的光路設 計使其能量穩(wěn)定、強度合適的激發(fā)光使熒光基團達到較高的能量水平，然后發(fā)射出較長波長 的散射光，該散射光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器cooling slow scaning CCD以 光子數量化檢測到光強度，同時反

3、應出標記物的數量。二、標記原理活體熒光成像技術有三種標記方法：熒光蛋白標記、熒光染料標記和量子點標記。熒光蛋白 適用于標記腫瘤細胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EGFP、RFP (DsRed)等。熒光染 料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7,可以標記抗體、多肽、小 分子藥物等。量子點標記作為一種新的標記方法，是有機熒光染料的發(fā)射光強的20倍，穩(wěn) 定性強100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調，并且光化學穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點。量子點是一種能發(fā)射熒光的半導體納米微 晶體，尺寸在100nm以下，外觀恰似一極小的點狀物

4、。它可以經受反復多次激發(fā)，而不像有 機熒光染料那樣容易發(fā)生熒光淬滅。已經證實了量子點的成像深度遠遠超過標準的熒光素如 果能與抗體結合配對，就可以作為跟蹤組織細胞的探針，或者探測低濃度的抗體。如果能解 決不同材料的量子點偶聯(lián)、功能化標記問題，就可以用量子點代替很多熒光染料分子。三、技術特性在活體動物光學成像技術中，相對于生物發(fā)光成像技術，熒光成像技術的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在：熒光染料、蛋白標記能力強熒光標記物種類繁多，包括熒光蛋白、熒光分子、量子點等，可以與基因、多肽、抗體等生 物分子標記，作為分子探針使用范圍廣。同時不同的熒光蛋白或染料還可對樣本進行多重標 記，同時成像。檢測的波長范圍從300nm到1

5、100nm，我們可以提供全光譜的濾光片實現(xiàn)幾 乎所有熒光標記的體內成像。信號強度大由于熒光是在外界光源激發(fā)下產生的能量轉移現(xiàn)象，其光子強度較其它光學信號更強，持續(xù) 時間長，信號所反應的樣本信息量更豐富，對信號接收儀器的要求相對較低，節(jié)省更多的實 驗成本。實驗成本低相對于活體生物發(fā)光成像來說，費用低廉，不需要底物。熒光發(fā)光基團只要在其合適強度的 激發(fā)光激發(fā)下就可以發(fā)出定波長的發(fā)射光信號，整個反映不需要添加任何昂貴的反應成分， 只要保證熒光基團穩(wěn)定，就可實現(xiàn)隨時激發(fā)隨時發(fā)光的效果?；铙w、尸體、器官全部可以進行成像5.由于熒光是基于物理能量轉移原理，對實驗樣本的生理狀態(tài)要求較低，可以實現(xiàn)活體、尸體、

6、 尸解組織器官樣本的光學成像。操作簡便，測量快速，每次檢測時間僅為毫秒級，同時可檢測多個動物6.分辨率提高，可達到2-3mm (生物發(fā)光的分辨率在3-5mm)但是，任何技術都是優(yōu)點和缺點并存，熒光成像技術常出現(xiàn)的問題主要有：自發(fā)熒光實驗樣本尤其是小動物會產生自發(fā)熒光，主要是來源于皮毛和血液的自發(fā)熒光。對于皮毛中 的黑色素是皮毛中主要的自發(fā)熒光源，其發(fā)光光線波長峰值在500-520nm左右，在一般的 綠色熒光作為探針時，影響最為嚴重。另外，食物中的葉綠素、動物血液都會產生較強的非 特異性自發(fā)熒光。但生物體內很多物質在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會發(fā)出熒光，產生的非特異 性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當

7、發(fā)光細胞深藏于組織內部，則需要較高能量的激發(fā)光 源，也就會產生很強的背景噪音。光被動物組織吸收特性在小動物實驗時，光在動物組織內傳播時會被吸收，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的 特性并不一樣，血紅蛋白(hemoglobin)，黑色素是造成體內可見光被吸收的主要因素，其 吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光、近紅外波段，血紅 蛋白的吸收作用卻很小，在偏紅光區(qū)域，大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。由此可 見，紅光的穿透性在體內比藍綠光的穿透性要好得多，因此逐漸成為活體熒光成像實驗的熱 點，活體熒光實驗建議選擇發(fā)射較長波長的標記物，近紅外熒光已經成為活體成像標記的重

8、 要選擇。背景光干擾在一般epi頂部熒光激發(fā)/檢測類裝置中，激發(fā)背景光的干擾也是熒光檢測手段的一個問題， 目前很多技術類革新都在試圖降低背景光的干擾，比如利用側面激發(fā)/頂部接收裝置、底部 透射激發(fā)裝置等改變常規(guī)成像儀器的光路設計，達到降低背景光的目的?，F(xiàn)有技術采用不同 的原理，盡量降低背景信號，獲取機體中熒光的準確信息。目前以NightOWL IILB 983 NC 320 為活體動物可見光成像系統(tǒng)為熒光成像的主要代表。第二部分儀器原理以Berthold公司的NightOWL IILB 983 NC320活體動物光學成像系統(tǒng)所示，體內可見光成 像系統(tǒng)主要由四部分組成：一、CCD選擇適當的CCD

9、鏡頭，對于體內可見光成像是非常重要的。更為合適的CCD是制冷型的前照 射CCD。選用的CCD鏡頭對于波長600nm左右的光必須具有非常高的靈敏度和量子效率，而 且由于需要探測的光源在皮下幾厘米處，其噪聲信號要盡可能的小NightOWLllLB 983 NC 320活體光學成像系統(tǒng)提供更為合適于熒光檢測的CCD是制冷型的前照射CCD，NC 320。NightOWL IILB 983 NC320活體動物可見光成像系統(tǒng)采用的CCD像素大小達到6.8旦m，像素 達到400萬，分辨率可達到5旦m。綜上所述，熒光成像對CCD相機選擇的要求是：CCD類型：單光子計數冷CCD，光子計數類CCD可以進行熒光量化

10、分析。CCD像素分辨率：由于熒光背景光較強，產生非特異性雜光干擾明顯，需要配有高分辨 率CCD的相機。CCD光譜覆蓋能力：全波長覆蓋。熒光對其它常見參數的要求：CCD量子效率（QE）:熒光反應光子能量強，CCD容易捕捉到光子信號，CCD不需要 對QE有過高的要求。CCD感光類別（前部感光/背部感光）：背部感光CCD芯片只有在檢測極弱光信號優(yōu)勢 明顯，但在強光檢測中與前部感光CCD芯片無差別，但其成本較高的弱勢使其不屬于熒光檢 測常規(guī)要素。CCD讀數噪音：在強光檢測中，CCD的噪音影響比起熒光背景光的影響微乎其微，只 有在發(fā)光檢測時才會顯出明顯優(yōu)勢。CCD暗電流：熒光檢測不需要對CCD暗電流有太

11、多要求。二、成像暗箱成像暗箱采用德國工藝、精鋼鍛造，內附高級光學避光涂層，可屏蔽宇宙射線及一切光源， 可以使暗箱內部保持完全黑暗，CCD所檢測的光線完全由被檢動物體內發(fā)出，避免外界環(huán)境 的非特異光污染。CCD鏡頭位于暗箱的頂部，光線通過光圈被CCD收集。暗箱里的CCD相機 是由軟件控制升降，升降精度可以達到0.01mm，相機高度與信號收集經過線性校對，通過 升降可以獲得寬視野拍照能力，拍照視野（FOV）從3.5厘米到26厘米，最多可同時檢測五 只小鼠，并且?guī)в屑訜嵫b置，可以保持觀察實驗動物的體溫。三、熒光激發(fā)和接收系統(tǒng)在活體熒光檢測中經常碰到的問題是熒光反射光造成的背景很強，影響信號的檢測。因

12、此在 活體熒光檢測中對于激發(fā)光能量的控制就顯得非常重要，當檢測樣本小，或檢測區(qū)域小，適 于用低能量的激發(fā)光，當樣本個體較大，或檢測位置較深，則高能量的激發(fā)光更適合，或同 時配合gooseneck鵝頸管激發(fā)裝置使用，效果更佳。同時，一般的熒光光源的能量會隨著時 間和波長的變化而變化，這對定量研究的體內實驗是極其不利的。在這樣的應用需求下， NightOWL IILB 983 NC 320活體動物可見光成像系統(tǒng)率先采用了熒光光源能量反饋控制系 統(tǒng)，并且通過該系統(tǒng)調節(jié)激發(fā)光的能量在檢測時間內的穩(wěn)定控制，對于每一次熒光檢測都可 保證持續(xù)穩(wěn)定的激發(fā)光，整個激發(fā)光路能量始終統(tǒng)一、穩(wěn)定，激發(fā)光能量直接關系到

13、發(fā)射光 信號強弱，需要確保在整個長時間多次成像中輸出穩(wěn)定的激發(fā)光，達到檢測時間內的穩(wěn)定控 制，特別是在多編組樣本分析時。儀器本身可以通過此系統(tǒng)控制激發(fā)光的能量，0%100%可 調節(jié)，針對不同的樣本使用不同強度的激發(fā)光，這就大大提高了活體熒光成像的靈敏度和穩(wěn) 定性，增加了活體熒光成像技術的應用范圍，使儀器成為開放性的檢測平臺。在熒光單元，配備典型的熒光激發(fā)/接收裝置，從頂部激發(fā)樣本發(fā)光，當相機對樣本進行調 焦定位時，會同時檢測到發(fā)射光信號，接收信號強度直接與相機的調焦高度相關，方便獲取 最佳觀測值。整個裝置需要配合選擇合適的光源和濾光片來激發(fā)熒光團，檢測樣本的發(fā)射光。 NightOWL IILB

14、 983 NC320還配有光能在線反饋控制裝置，使整個激發(fā)光路能量始終統(tǒng)一、 穩(wěn)定，對于每一次熒光檢測都可保證持續(xù)穩(wěn)定的激發(fā)光。儀器對于在不同時間發(fā)出的同一波 長的光線，或者不同波長的光線，光能穩(wěn)定對于定量研究非常重要，激發(fā)光能量直接關系到 發(fā)射光信號強弱，特別是在多編組樣本分析時，需要確保在整個長時間多次成像中輸出穩(wěn)定 的激發(fā)光。而光源本身能量不是恒定不變的，為此我們的光路配有能量在線反饋控制裝置， 實時監(jiān)控光路，反饋補償光源能量變動導致的激發(fā)能量突增或缺失，以確保整個激發(fā)單元的 能量始終統(tǒng)一。光源的光效穩(wěn)定性有利于定量觀察。為了熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能穩(wěn)定均勻地照射在待測樣本上，同時為了檢測

15、微小樣本或者進 行深度檢測，NightOWL IILB 983 NC320活體動物可見光成像系統(tǒng)設計了一系列激發(fā)光組件 實現(xiàn)上述目的。環(huán)狀照射裝置，激發(fā)高度可調，其特點是輸出光線均勻統(tǒng)一，使照射在樣品 上的激發(fā)能量始終保持統(tǒng)一。鵝頸管照射裝置，可以得到spot聚光，針對老鼠等試驗動物 局部（頭部、四肢、某一內臟部等）或小體型物種（蠶、果蠅等）。魚尾型照射裝置的特點 是聚光激發(fā)，高能量激發(fā)光可以提高穿透樣本皮層深度，增強發(fā)射光的強度，適合激發(fā)弱信 號（由于濃度低或皮下深度原因）。上述激發(fā)裝置采用多模塊即插即用式設計，使應用更具 針對性及廣泛性，操作簡便。另外操作軟件可以直接控制激發(fā)光源的照射能量

16、，它有利于成像系統(tǒng)根據每一種熒光物質、 或實驗樣本種類及其部位作針對性的調節(jié)，在同一樣本中對不同熒光團的數量比較就會很容 易實現(xiàn)。軟件控制的濾光片支架提供在一個測讀次序中激發(fā)光和發(fā)射光濾光片的快速轉換， 特別對比率制檢測讀數的應用是非常重要的。操作軟件中靈活的檢測方案設定功能可完成在 同一時間內對不同波長發(fā)射光的檢測，發(fā)射光濾光片之間的轉換時間小于500ms，遠快于相 機的測讀時間。高光阻寬透射率濾光片被安裝在儀器最佳的位置，如果客戶需要，可以很方 便的更換其它種類的濾光片，Berthold提供全波長濾光片組，多達幾百中濾光片可供選擇。 通常，我們選擇經常使用的6種熒光檢測配置對應的濾光片，如

17、下所示：GFP:Ex475/20 (53183)Em520/10 (39805)dsRed/RFP:Ex530/20 (38536)Em600/20 (50477)Cy5:Ex630/20 (50097)Em680/30 (49180)Cy5.5:Ex630/20 (50097)Em700/20 (50479)Cy7:Ex700/20 (50475)Em780/20 (50476)ICG Ex740/30 (50480)Em820/30 (50481)(Cardiogreen):為了進一步提高靈敏度，也可以配置先進的熒光透射儀，用于從樣本底部激發(fā)樣本。激發(fā)光波長為625nm，強度可調。透射區(qū)域

18、大小為20cm*20cm。四、軟件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)負責儀器控制和圖像分析。軟件控制鏡頭的焦距，曝光時間，濾光鏡的更換，照明 燈的開啟，相機的升降，操作簡便。典型的成像過程是：小鼠被麻醉后放入成像暗箱平臺， 軟件控制相機的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動 關閉照明燈，在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內發(fā)出的光，即為活體熒光成像。與第 一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成 圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數據處理及保存工作。當選 定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數，獲得實驗數據。軟

19、件的數據處 理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。原始數據與處理后數據分開存檔（根據GLP規(guī)則）多種圖像單位方式，以counts或Photon計數均可可以進行圖像輸入及輸出（由Winlight生成的TIF文件可很容易的被其它軟件包分析處理，例如Image1 Pro, Media Cybernetics）從而實現(xiàn)與PET圖像的兼容。去宇宙射線功能，將宇宙射線造成的干擾均化處理三維成像分析多孔板計算功能-幾何學圖像分析，可計算選定區(qū)域的光強度-色彩疊加功能，例如帶有生物發(fā)光圖像的影像合成；帶有雜交信號的熒光凝膠成像；或其它類型的熒光成像-量化分析-分析結果以電子表格形式輸出-圖

20、像處理功能強大，帶有圖像對比、圖像增強工具。-放大功能-插入部分的界定及測算功能-第三部分應用領域通過NightOWL IILB 983活體動物光學成像系統(tǒng)，可以觀測到腫瘤細胞的發(fā)展進程以及藥物 治療所產生的反應，并可用于分子探針、藥物制劑學、臨床前研究等領域。一、熒光蛋白標記的應用腫瘤學應用NightOWL IILB 983 NC320活體動物光學成像系統(tǒng)能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種 癌癥模型中腫瘤的生長?；铙w熒光成像技術能夠無創(chuàng)傷定量檢驗小鼠整體的原位瘤、皮下瘤 等?；铙w熒光成像技術提高了檢測的敏銳度，可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和 評估。熒光蛋白癌癥模型可應用于癌癥體內

21、用藥的療法中。利用無創(chuàng)傷活體熒光成像對癌細胞生長 的檢測，可對癌癥治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估。這種方式提供一 個很好的對癌細胞的反應和復發(fā)評估的預診斷途徑。該設備可置于藥物保護區(qū)域內，用于藥 物的常規(guī)檢測。而且，成像分析軟件更有精確定量的特性，使數據分析更容易。定量檢測整 體老鼠腫瘤，利用無創(chuàng)傷檢測手段長期跟蹤觀察治療方法。二、熒光染料標記的應用分子探針分子探針的一端聯(lián)有能夠和生物體內特異靶點結合的分子結構（如肽類、酶的底物、配體等）， 另一端則是熒光染料。有科研人員應用Cy5.5標記的抗體的體內代謝實驗，可見肝、腎等處 的分布。這是分子探針應用NightOWL HLB 983 NC320活體動物光學成像系系統(tǒng)的先例。熒 光探針本身也需要進一步改進與提高，需要改進探針的通透性，提高活性和特異性，降低毒 性和副作用等。目前這些改進都有專門的公司和機構在研究中。藥物治療效果應用透射儀從樣本底部激發(fā)光源，可以提高活體熒光成像的靈敏度和檢測的深度。藥物靶