膜片鉗技術(shù)(研究生平臺課)課件

1、膜片鉗技術(shù)講座 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室 李玉榮 在一書的序言中寫道： 通常，一篇非常專業(yè)的科技論文公開發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專業(yè)期刊或者是著名的科學(xué)雜志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。 然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當(dāng)時還不太有名，刊登的雜志也不算頂級，可是論文發(fā)表20年來，已神話般地被世界各地的科技工作者引用了一萬二千余次，遍及生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，而且近年來還在以平

2、均每年約一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在歐洲生理學(xué)雜志（Pflugers Archiv.）上的著名論文。在此之前五年，身為德國科學(xué)家的Neher和Sakmann共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾 生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。膜片鉗技術(shù)的作用和影響由此可見一斑。生物電現(xiàn)象研究簡史18世紀(jì)末，意大利醫(yī)生和生理學(xué)家Galvani首先在生物體(蛙)發(fā)現(xiàn)了生物電現(xiàn)象。1902年，Bernstein提出了細胞生物電產(chǎn)生的膜學(xué)說。1936年，英國劍橋Young描述了頭足軟體動物槍烏賊支配其

3、外套膜肌的巨大軸突直徑可達1mm。1939年，Hodgkin和Huxley 把槍烏賊巨軸突用于細胞內(nèi)膜電位的記錄，首次記錄到膜兩側(cè)的靜息電位。這一工作的意義在于實驗測定的靜息電位與根據(jù)細胞膜內(nèi)外鉀濃度經(jīng)Nernst公式計算的鉀平衡電位非常接近，從而有力地支持了Bernstein關(guān)于靜息狀態(tài)下細胞膜對鉀離子有選擇性通透的膜學(xué)說。1955年，Hodgkin和Keens在研究神經(jīng)軸突膜對鉀離子通透性時發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運動很像是通過許多狹窄孔洞的運動，并提出了“通道”（channel）的概念。細胞膜對離子通道的通透性（膜電導(dǎo)）的直接測定是從應(yīng)用電壓鉗（voltage clamp）技術(shù)以后開始的

4、。 電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設(shè)計的，后經(jīng)Hodgkin、Huxley 和Katz等加以改進，并成功地應(yīng)用于槍烏賊巨軸突動作電位期間離子電流的研究。 他們直接測定了膜電流并分析了電流的離子成分，推算出動作電位期間鈉電導(dǎo)和鉀電導(dǎo)的變化。極大的推動離子通道的研究工作，其中的基本概念至今仍被沿用。鑒于Hodgkin、Huxley 和Eccles對通道研究的突出貢獻，獲得1963年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎。A.L.Hodgkin 19141998A.F.Huxley 1917 1972年Katz通過記錄神經(jīng)肌接頭終板膜上乙酰膽堿噪聲，發(fā)現(xiàn)ACh的量子性釋放引起的終板電位及微終板電位，指

5、出其與離子通道的電導(dǎo)、開放時間及開放頻率的對應(yīng)關(guān)系，獲1970年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 1976年Neher和Sakmann完成電極與膜之間50M的封接，首次記錄到去神經(jīng)蛙肌纖維膜上的單通道電流，為證實生物膜離子單通道是以全或無規(guī)律、隨機開放關(guān)閉的假說提供了有力依據(jù)。 1980年，Neher等利用負壓吸引實現(xiàn)了G封接，背景噪聲顯著減低。 1991年膜片鉗技術(shù)的創(chuàng)始人Neher和Sakmann榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎。Patch clamp Erwin Neher Bert Sakmann 1944 1942一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片

6、鉗實驗方法六、與膜片鉗技術(shù)相結(jié)合的其它研究 方法一、離子通道的概念 離子通道（ion channels）是細胞上的一種特殊整合蛋白，在脂質(zhì)雙分子層膜上構(gòu)成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當(dāng)大小和電荷的離子以被動轉(zhuǎn)運的方式通過。 離子通道是生命活動的基礎(chǔ)，無論動物或植物、單細胞生物或多細胞生物的細胞膜上，都有離子通道存在。 離子通道的最基本功能是產(chǎn)生細胞生物電現(xiàn)象，即與細胞的興奮性直接相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，才進一步派生出神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、腺體的分泌、肌肉的運動。因此，離子通道是可興奮細胞膜上的基本興奮單元，具有重要的生理功能。 離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控特性。前者包括通道對離子大小

7、的選擇性及電荷選擇性，在一定條件下，某一種離子只能通過與其相應(yīng)的通道跨膜擴散，各離子通道在不同狀態(tài)下，對相應(yīng)的離子的通透性不同，如安靜時神經(jīng)細胞膜離子通道對K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時，對Na+通透性又比K+大1020倍，表明了通道對離子的選擇性的差異 。 離子通道的另一特征是離子通道的門控特性，離子通道一般都具有相應(yīng)的閘門，通道閘門的開啟和關(guān)閉過程稱為門控（gating）。正常情況下，通道大多處于關(guān)閉狀態(tài)，只有在特定的條件下，通道的閘門才能開啟，引起離子的跨膜轉(zhuǎn)運。 一般認為，不同信號控制其開放和關(guān)閉，通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，正常情況下，通道處于備用狀態(tài)，在外界因素作用下，通道

8、允許某種或某些離子順濃度差和電位差通過膜，相當(dāng)于通道開放，稱為激活（activation）。通道的失活（inactivation）是與通道關(guān)閉不完全相同的功能狀態(tài)。 二、離子通道的分子結(jié)構(gòu) 隨著生物物理學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應(yīng)用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達等技術(shù)的結(jié)合，使徘徊多年的離子通道研究迅速進入到分子、亞分子水平，人們已有能力從分子水平來確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性。 電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu) 經(jīng)純化、克隆和測定表明，離子通道蛋白是由多個亞基構(gòu)成的復(fù)合體。電壓門控離子通道由、等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由、1

9、和2亞基組成，鈣通道由1、2、和亞基組成，鉀通道由和亞基組成等。 在各亞基中，亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用。 亞基是一條跨膜多肽，由18002000個氨基酸組成。它包括四個跨膜功能區(qū)（），每個功能區(qū)含有約300個氨基酸，組成的6個螺旋區(qū)段（S1S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5個均為疏水性跨膜螺旋片段。在膜外側(cè)面有連接糖基的部位和毒素的結(jié)合位點；在膜內(nèi)側(cè)則有蛋白激酶的磷酸化位點。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過的部分稱為孔道區(qū)（pore region）或P區(qū)，四個功能區(qū)圍繞一個中心對稱排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道

10、內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴氨酸），對膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用。 當(dāng)膜去極化時，每一個功能區(qū)的S4肽段做螺旋運動而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門控電流，導(dǎo)致通道構(gòu)象變化。當(dāng)四個功能區(qū)S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時，則通道便處于激活開放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱為激活閘門（activation gate, m閘門）在通道開放后，很快功能區(qū)的S6與功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門（inactivation gate, h閘門），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過程。 鉀通道根據(jù)分子生物學(xué)分類為KV和KIR兩大類，分別對應(yīng)于功能性分類中的外向整流和內(nèi)向

11、整流鉀通道。KV類又分為KV1、KV2、KV3和KV4四組，每組又按發(fā)現(xiàn)克隆的次序先后進一步分類，如KV0、KV1.2、KV1.5等。除KV1.4為瞬時外向鉀通道（KA）外，其余在功能上都屬于或接近于延遲整流鉀通道。 在結(jié)構(gòu)上KV類鉀通道由4個亞基構(gòu)成，每個亞基僅有一個功能區(qū)，由6個跨膜區(qū)段組成。因此，電壓門控鉀通道的一個亞基相當(dāng)于鈉通道和鈣通道的一個跨膜區(qū)。 KIR類鉀通道不同于KV類和鈉、鈣通道，其每個亞基只有兩個跨膜肽類（M1和M2），其間由H5連接，因M1、M2和H5的序列與KV類的S5、S6相似，所以這兩類鉀通道可能具有相同的基本孔道結(jié)構(gòu)。由于沒有S4樣結(jié)構(gòu)，其電壓門控機制可能與M2

12、上帶負電荷的氨基酸殘基有關(guān)。 化學(xué)門控離子通道的基本結(jié)構(gòu) 當(dāng)各種化學(xué)物質(zhì)與化學(xué)門控離子通道相應(yīng)部位結(jié)合后，會導(dǎo)致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴性鉀通道等。 神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道又稱為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道及谷氨酸門控離了通道三大類。 乙酰膽堿門控離子通道 由12 五個亞基組成，呈五邊形排列。每個亞基有4個跨膜區(qū)段即M14。其中M2跨膜區(qū)段中除疏水性氨基酸外，還間斷出現(xiàn)少量的絲氨酸和蘇氨酸，它們排列在螺旋的一側(cè)，由五個亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。每個

13、亞基的N端和C端都朝向膜外，其中1和2亞基N端的細胞外部分各有一個ACh結(jié)合位點，當(dāng)兩個ACh分子與亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開放，主要引起Na+內(nèi)流增多。 近來研究表明，一些神經(jīng)遞質(zhì)也可以通過與膜受體結(jié)合后，激活細胞膜內(nèi)的G蛋白，通過G蛋白亞基或亞基直接調(diào)節(jié)離子通道的活動。也可以通過G蛋白耦聯(lián)受體生成第二信使，進而影響離子通道的活性。三、離子通道的分類非門控離子通道 門控離子通道 電壓門控性通道化學(xué)門控性通道機械門控性通道 1、非門控性離子通道 有些離子通道始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時進出細胞，并不受外界信號的明顯影響，這些通道稱為非門控離子通道。如神經(jīng)和肌肉細胞在安靜狀態(tài)下

14、靜息電位的產(chǎn)生，是由于細胞膜上的離子通道允許K+自由進出細胞，而引起的K+電化學(xué)平衡電位，此種K+通道即屬于非門控性離子通道。 2、電壓門控離子通道 電壓門控離子通道（voltage-gated ion channels）的開啟或關(guān)閉受膜電位的變化決定，具有電壓依賴性，同時通道往往還與電位變化的時程有關(guān)，即具有時間依賴性。這 類通道在決定細胞的興奮性、不應(yīng)期和傳導(dǎo)性以及維持細胞正常體積等方面發(fā)揮重要作用。電壓門控離子通道一般以最容易通過的離子命名，如鈉離子通道、鈣離子通道及鉀離子通道等。 電壓門控鈉離子通道 鈉離子通道（sodium channels，簡稱鈉通道），是選擇性地容許Na+跨膜通過

15、的離子通道。根據(jù)其對鈉通道阻滯劑河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）和-食魚螺毒素（-conotoxin,- CTX）的敏感性不同分為神經(jīng)類、骨骼肌類和心肌類鈉通道三類。 電壓門控鈣離子通道 鈣離子通道（calcium channels，簡稱鈣通道）是選擇性容許Ca2+跨膜通過的離子通道。Tsien RW等根據(jù)肌細胞和神經(jīng)元電壓門控離子通道對膜電位變化的敏感性，將神經(jīng)元質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道分為T（transient）、L（long lasting）及N（neither T, nor L）三種類型，后來應(yīng)用不同的毒素阻斷鈣電流的某種特定的成分，在神經(jīng)元又增加了P（purkinje）、

16、Q和R型，共6型。 電壓門控鉀離子通道 鉀離子通道（potassium channels，簡稱鉀通道）是廣泛存在、種類最多、最為復(fù)雜的一大類離子通道，僅電壓門控鉀通道就已克隆出幾十種亞型，根據(jù)其電流動力學(xué)特點可分為延遲外向整流鉀通道、瞬時外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道三類。 3、化學(xué)門控離子通道 化學(xué)門控離子通道（chemically gated ion channels）又稱配體門控通道（ligand gated channels）。這一類通道的門控行為主要受其相應(yīng)配體的控制，配體是包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等各種激動劑和阻滯劑在內(nèi)的多種化學(xué)因素。當(dāng)激動劑與化學(xué)門控離子通道結(jié)合后，會引起通道蛋白構(gòu)型變化

17、，導(dǎo)致通道開放，產(chǎn)生離子電流。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道也稱為離子通道型受體，其結(jié)構(gòu)中具有與神經(jīng)遞質(zhì)特異性結(jié)合的位點，當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)與其結(jié)合位點結(jié)合后，將引起通道開放。神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道主要包括乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道和谷氨酸門控離子通道三大類。 4、機械門控離子通道 機械門控離子通道（mechanically gated ion channels）是由機械牽拉激活的離子通道，主要見于觸覺和聽覺感受器，如機械刺激作用于蝦類牽張感受引起通道開放，出現(xiàn)Na+內(nèi)流和K+外流，產(chǎn)生感受器電位；聲波傳入內(nèi)耳后，引起內(nèi)耳毛細胞頂端纖毛發(fā)生彎曲或偏斜，從而使毛細胞頂端機械門控通道開放，陽離子內(nèi)流產(chǎn)

18、生聽覺的感受電位。 5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其它門控特性的離子通道存在，如細胞容積敏感的鉀通道（Kvo l）在細胞腫脹時通道開放；Na+激活鉀通道（KNa）對電壓、細胞內(nèi)ATP濃度及細胞內(nèi)鈣均不敏感，只有細胞內(nèi)Na+濃度升高到20mmol/L以上時開放。 四、離子通道的研究技術(shù) 在進行細胞電生理研究中，最重要的物理學(xué)定律是歐姆定律（Ohms Law）。當(dāng)電流（I）流經(jīng)一電阻（R）時，會在其兩端產(chǎn)生電位差（V），即V=IR。此時，電流與電壓的關(guān)系（I-V）是一條通過原點的直線，其斜率即為該通道的電導(dǎo)，這是適用于線性系統(tǒng)的歐姆定律，而生物系統(tǒng)并非線性系統(tǒng)，只是應(yīng)用歐姆定律進

19、行近似的描述。 1、電壓鉗技術(shù)的基本原理電壓鉗技術(shù)是通過一個反饋電路使膜電位保持在指定的水平，當(dāng)離子通道開放產(chǎn)生跨膜電流，導(dǎo)致膜電位改變時，可通過反饋電路經(jīng)微電極向胞內(nèi)注入電流，補充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，使膜通透性發(fā)生改變時膜電位保持不變，此時注入電流的變化就可反應(yīng)膜電導(dǎo)或膜電流的改變。電壓鉗技術(shù)工作原理如示意圖：2、膜片鉗技術(shù)的基本原理膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)基礎(chǔ)上，以記錄通過離子通道的離子電流來研究細胞膜上單個（或多個）離子通道分子活動的電生理技術(shù)。膜片鉗技術(shù)可用一根玻璃微電極同時完成膜片（或全細胞）電位的監(jiān)測、鉗制及通道電流的記錄。 隨著該技術(shù)的逐漸完善及應(yīng)用，目前已成為

20、從功能角度探討各種生理、病理生理及藥物作用機制最直接、最理想的電生理學(xué)研究方法，也為多學(xué)科探討生命活動規(guī)律、疾病與轉(zhuǎn)歸機理及藥物作用等細胞和分子水平的研究，開辟了廣泛前景。膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑12m的玻璃微電極尖端與酶處理干凈的細胞膜接觸，通過2030cm H2O的負壓吸引造成電極尖端與細胞膜形成高阻封接（10100G），使電極尖端下的小塊膜片與膜的其它部分在電學(xué)上絕緣，并在此基礎(chǔ)上固定膜片電位，監(jiān)測幾個m2膜片上13個離子通道活動的方法。 膜片鉗技術(shù)具有1pA的電流分辨率,10 s 的時間分辨率和1 m2 的空間分辨率，從而使其成為在活體細胞上進行電生理學(xué)研究的重要手段。 3、膜片鉗記錄的

21、模式 根據(jù)研究需要及記錄膜片的不同，膜片鉗記錄可形成以下四種基本模式 1.細胞貼附式（cell attached patch） 2.內(nèi)面向外式（inside-out patch） 3.外面向外式（outside-out patch） 4.全細胞記錄式（whole cell recording） 4、膜片鉗實驗系統(tǒng)的組建 膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等。 視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗放大器數(shù)據(jù)采集及分析軟件計算機五、膜片鉗實驗方法 膜片鉗實驗方法包括：微電極的制備、

22、細胞標(biāo)本的制備、高阻封接的形成、離子單通道電流的記錄或全細胞記錄 1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細管拉制而成。玻璃微電極的選材和拉制質(zhì)量直接影響封接電阻及記錄時的噪聲大小。 （1）選材 膜片鉗實驗用微電極可根據(jù)不同記錄模式選用不同的玻璃毛細管拉制。從玻璃毛細管材料方面,可分為軟質(zhì)玻璃和硬質(zhì)玻璃兩類。（2）拉制 膜片鉗實驗用微電極與細胞外記錄和細胞內(nèi)記錄用微電極不同，其尖端較短，錐度較大，尖端直徑為15m，充灌林格氏液時阻抗約15M，因此一般采用兩步拉制法。第一步將玻璃軟化，拉出一個長710mm、直徑200400m的桿，第二步再從桿中央以較小電流拉出兩根尖端錐度較大的微電極。（3）處理

23、 微電極拉制成功后，其尖端需進一步處理。這一過程包括涂硅酮樹酯（sylgard coating）和熱拋光（heat polish）。前者是將硅酮樹酯涂于微電極尖端以外部分，然后加熱使其烘干固化，達到使浸入浴液中的微電極表面呈疏水性，減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容。熱拋光是在顯微鏡下，將微電極尖端接近熱源，使電極尖端表面變得更加寬闊和光滑，同時也使粘涂到電極尖端的Sylgard被燒掉或蒸發(fā)。經(jīng)熱拋光處理的微電極可使高阻封接的成功率明顯提高。 （4）充灌 微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.2m的濾膜或濾紙過濾。充灌時首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端部分充滿液體，然后再從電極尾

24、端充灌。在充灌中應(yīng)避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡，如有氣泡可使電極尖端向下，輕敲管壁除去。也應(yīng)避免充灌電極內(nèi)液太多，否則影響實驗噪聲基線。 2、細胞標(biāo)本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實驗所需標(biāo)本均為具有生物活性的單個離體細胞，其來源包括急性分離、原代和傳代培養(yǎng)的細胞。從理論上來講，膜片鉗實驗用的細胞標(biāo)本可來自體內(nèi)各種組織細胞，只要細胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機械分離及清洗等步驟。3、高阻封接的形成 高阻封接形成與否是記錄細胞離子通道電流能否成功的前提，是進行膜片鉗實驗的關(guān)鍵一步。微

25、電極尖端與細胞膜形成封接的過程，可以采用軟件或刺激器發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過示波器或顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器或示波器上可見一直線。進行高阻封接時，需注意的是：在微電極未入液之前常施以正壓，使電極內(nèi)有液體從電極尖端流出，防止浴液表面灰塵或溶液中粒子附著于電極尖端，影響高阻封接。電極尖端與細胞膜接觸，稍加負壓后電流波形變得平坦，此時，如使電極超極化，則有助于加速形成高阻封接。電極入液后封接的成功率與入浴液后的時間呈反比，電極內(nèi)液中的肽類或蛋白質(zhì)成分也會有礙于封接形成。 4、離子通道電流的記錄 單

26、通道記錄 離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)勢，當(dāng)尖端直徑為1m的玻璃微電極與細胞膜形成高阻封接后，電極尖端下的一小塊膜片上，僅含有一個或幾個離子通道，根據(jù)單通道電流的特征，很容易得到對某種離子有選擇性通透的單一的離子通道電流。由于單通道電流大小僅為1pA（10-12A）左右，要記錄到這一微小電流，除盡量降低膜片鉗系統(tǒng)噪聲及電極噪聲外，良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件，電阻值愈大，噪聲電流愈小。 全細胞記錄全細胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡管它記錄的是細胞膜多個離子通道開放產(chǎn)生的宏膜電流，但由于該模式既可以對離子通道的性質(zhì)和分類進行宏觀性質(zhì)的分析，也可以對離子通道的構(gòu)造、分布

27、與功能進行微觀性質(zhì)的分析。還可以通過測量膜電容對細胞分泌活動進行研究，從而使其成為當(dāng)前電生理研究中應(yīng)用最廣泛的一種模式。全細胞記錄模式可用于測定在某個時間和電壓情況下，離子通道電流的大小，觀察其電壓依賴性特征，如以膜電位為橫座標(biāo)，電流強度為縱座標(biāo)，則可繪制出電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）。在電流為零時的膜電位被稱為反轉(zhuǎn)電位。其大小取決于膜兩側(cè)的離子濃度及通道的離子選擇性，反映了某種通道的電壓依賴性及藥物等因素對通道電壓依賴性的影響，常作為全細胞記錄模式結(jié)果分析的指標(biāo)之一。此外，由于電壓門控通道的電壓依賴性，在膜電位出現(xiàn)階梯狀改變時，可以記錄到一個過渡電流即尾電流（tail current）。

28、由于全細胞電流是通過每個離子通道電流的總和，而離子通道又隨時間的推移呈概率性關(guān)閉，因此尾電流的強度也隨全細胞電流強度的變化而按指數(shù)相關(guān)數(shù)衰減，測定尾電流強度的變化也可作為結(jié)果分析的指標(biāo)之一。 鈉通道在多種細胞尤其是在神經(jīng)、肌肉等可興奮細胞中廣泛存在。鈉通道激活可導(dǎo)致Na+快速內(nèi)流、細胞去極化，產(chǎn)生動作電位的上升支，因此，鈉通道的活性對細胞的功能有重要的影響。鈉通道的激活是電壓門控的，當(dāng)細胞膜去極化至-60mV左右時，即可引起膜上大量鈉通道激活。產(chǎn)生一迅速激活并迅速失活的內(nèi)向電流，當(dāng)去極化至-30 mV左右時達到最大，反轉(zhuǎn)電位為+30 mV左右。當(dāng)靜息膜電位升至-50 mV左右，可使Na+通道完

29、全失活，不能引起鈉通道開放。 鈉通道電流的測定在參數(shù)設(shè)計上應(yīng)使保持電位鉗制在-80 mV以下，此時給予不同程度的去極化階躍電壓，則可得到鈉電流，由于鈉通道激活和失活均很快，因此刺激脈沖波寬常為2050 ms。為證實所測電流為鈉電流，常借助于工具藥，如河豚素（TTX）用于細胞外液中，可以選擇性阻斷鈉通道。由于神經(jīng)與心臟中的鈉通道亞型不同。心肌鈉通道對TTX的敏感度比神經(jīng)低數(shù)百倍。 當(dāng)膜電位鉗制在-80 mV，去極化中還可能引起某些鉀通道成分的激活，此時可使用鉀通道阻斷劑或?qū)㈦姌O液中KC1以CsC1取代可起到抑制鉀通道激活的作用。 鈣通道電流的測定由于電壓依賴的鈣通道廣泛存在于各種組織中，是興奮時

30、鈣內(nèi)流的主要途徑，因此研究電壓門控鈣通道的調(diào)節(jié)及藥物對其影響是非常重要的。電壓門控鈣通道又分為L、N、T、P、Q及R等型，其中L型鈣通道的電導(dǎo)最大，在心腦血管疾病的治療中有重要意義，如二氫吡啶類鈣拮抗劑就選擇地作用于L型鈣通道。（1）L型鈣通道: 激活的膜電位較高，膜電位鉗制在-50 mV以下，這樣即較大程度的激活了L型鈣通道，又有效的抑制了鈉通道的活性;L型鈣通道的激活與失活時間較長，往往需幾十甚至數(shù)百毫秒，因此去極化脈沖的保持時間在200500 ms之間; L型鈣通道的最大電流約在0+10 mV;反轉(zhuǎn)電位為+40+50 mV左右。L型鈣通道除對二氫吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等鈣拮

31、抗劑敏感外，對某些無機離子如Cd2+也很敏感。20M Cd2+就可使鈣通道活性抑制90%以上。因此常被用作全細胞膜片鉗實驗中的工具藥。值得注意的是，L型鈣通道電流測定時,可隨時間產(chǎn)生衰減,即所謂Rundown現(xiàn)象。盡管許多學(xué)者進行了大量的研究，但仍不能有效地防止這一現(xiàn)象，嚴重時在10分鐘之內(nèi)就可使鈣電流減少3050%。如不加以矯正，則直接影響結(jié)果的可靠性，尤其是給藥前后的對比，因此在實驗設(shè)計中，必須考慮到這一因素，并設(shè)立嚴格的對照組。（2）T型鈣通道: 激活所需的膜電位較低,通常為-100-60 mV。此差別常用來與L型鈣通道進行鑒別，如將膜電位鉗制在-40 mV時，去極化只能得到L型鈣電流，

32、因T型通道已被完全抑制。當(dāng)有鈉通道和鉀通道拮抗劑存在時，膜電位被鉗制在-100 mV時，進行不同程度的去極化，所得到的內(nèi)向電流可分為兩種成分，即低閾值（-50-40 mV）快速失活的T型鈣通道電流和高閾值（-100 mV）緩慢失活的L型鈣通道電流。 此外，T型鈣通道對雙氫吡啶類鈣拮抗劑均不敏感，Cd2+對其抑制也不明顯。（3）N型鈣通道則僅存在于神經(jīng)細胞和突觸部位，這種通道激活時，所需的膜電位與T型鈣通道相似，范圍在-10040mV。此型電流不能被二氫吡啶類鈣拮抗劑所抑制，但可被較低濃度的Cd2+所阻斷。-conotoxin是其具有相對特異性的拮抗劑。P型通道也僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可被FXT（一種蜘蛛毒素）所阻斷，對其它的鈣通道阻斷劑均不敏感。 鉀通道電流的測定鉀通道是亞型最多、分布最廣的一大類離子通道，現(xiàn)在已知并具有明確功能及動力學(xué)特性的鉀通道就有十多種，各種鉀通道亞型的特征電流不如鈉或鈣通道