內(nèi)源性活性物質(zhì)

1、體內(nèi)藥物分析內(nèi)源性活性物質(zhì)的分析1內(nèi)源性活性物質(zhì)1、定義內(nèi)源性生物活性物質(zhì)是指人類和哺乳動物體內(nèi)天然存在的具有生理功能和生物學活性的物質(zhì)，它們可以是小分子化學物質(zhì)，也可能是糖類、生物活性肽類、核苷和核酸、生長因子、內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子、細胞因子和蛋白質(zhì)等。2、研究意義 許多重大的突破都是由于發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)那些具有重要生理活性的物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)這些物質(zhì)的其它相關物質(zhì)?；蚩寺∈埂?受體一指導” 和 “ 酶一指導” 的新藥的發(fā)現(xiàn)在方法學上得到完善。D NA 重組和轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展已使蛋白質(zhì)和肽類藥物的生產(chǎn)及其它內(nèi)源性分子作為新藥成為可能。2蛋白質(zhì)類內(nèi)源性活性物質(zhì)的分析3Western Blot Wester

2、n Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中的表達情況的信息。4熒光探針定義： 與蛋白質(zhì)、核酸(DNA或RNA)或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種熒光性質(zhì)發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游镔|(zhì)的性質(zhì)和行為。 5熒光探針 熒光探針除應用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術以及DNA測序上都有著廣泛的應用。 可以分為熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點

3、、分子信標幾類6與G蛋白偶聯(lián)受體相關的內(nèi)源性活性物質(zhì)對心肌細胞功能和形態(tài)的影響7免疫組織化學法 免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 免疫化學技術近年來得到迅速發(fā)展。50年代還僅限于免疫熒光技術，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實用的免疫酶技術。8免疫組織化學染色法 免疫組

4、織化學染色法是指在抗體上結合螢光或可呈色的化學物質(zhì)，利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應，檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在，此方式不只可以用來測知抗原的表現(xiàn)量也可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。只要是能夠讓抗體結合的物質(zhì)，也就是具有抗原性的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病原體等都可偵測。 9免疫組織化學染色法 免疫組織化學的優(yōu)勢在于專一性、靈敏度、簡便快速以及成本低廉，所以廣為醫(yī)院采用，通常是借由特定的腫瘤標記來篩選癌癥。免疫組織化學染色法對基礎研究及預防和診療上都是相當重要的一個方法。10發(fā)光免疫測定luminescence immunoassay;LIA;luminescent immun

5、oassay 將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應相結合，用于檢測抗原或抗體的技術。 以發(fā)光物質(zhì)標記抗原或抗體，免疫反應后引發(fā)發(fā)光反應，根據(jù)發(fā)光強度對抗體或抗原進行的測定。 11層析 chromatography 基于不同物質(zhì)在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術。當流動相(液體或氣體)流經(jīng)固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時，各組分沿固定相移動的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。 層析是應用蛋白質(zhì)的等電點不同而分析分離蛋白質(zhì)的。12雙向凝膠電泳（2D膠電泳）的基本原理先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點在 pH 梯度膠內(nèi)進行等電聚焦，然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進行

6、 SDS第二次電泳分離。第一向進行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當?shù)鞍走w移至其等電點 pH 位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。當?shù)鞍讛U散到低于其等電點 pH 區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動。同樣，如果蛋白質(zhì)擴散到高于其等電點的 pH 區(qū)域時，則帶負電，在電場的作用下會向陽極移動。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的p

7、H 梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預制膠條 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的 IPG 膠條在含有 SDS 的緩沖液中平衡。第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向進行 SDS電泳（聚丙烯酰氨凝膠電泳），按分子量大小進行分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。 13IPG 膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結構的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構成

8、了分布在pH 310不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。142D膠電泳數(shù)據(jù)庫15細胞因子的測定ELISA系列的試劑盒 細胞因子絕大部分是蛋白質(zhì)，并且一般都用ELISA試劑盒測定。16ELISA法酶聯(lián)免疫吸附劑測定是主要的測蛋白的方法17ELISA 的原理ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種 敏感性很高的實驗技術。18基礎:抗原或

9、抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留其酶的活性。19測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應，洗滌加入酶標記抗原或抗體，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，由此進行定性或定量分析。20免疫測定在臨床檢驗中的應用的可行性由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，尤其采用基因工程方法制備包被抗原來檢測樣本中的相應抗體，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度極高的EL

10、ISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。21綜上，由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用 。22舉例：多糖蛋白的檢測ELISA試劑盒法 CRP，肺炎球菌細胞壁c多糖蛋白，一種急性時相（期）蛋白，亦稱C反應蛋白，正常參考值10mg/L。本身由肝細胞產(chǎn)生能結合肺炎球菌細胞壁糖蛋白，能監(jiān)測疾病的發(fā)展情況為非特異性的檢驗指標，很多疾病時都可以表現(xiàn)出來。23RIA法兒 放射免疫測定/放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) 24RIA法基本原理： 在放射免疫分析的實驗中，加入超量的標記抗原*A

11、g與未標記抗原Ag（即：待測抗原）與較少量的抗體（Ab）競爭性結合。 如果實驗結果所計量到的結合物（*Ag-Ab）放射活性較高，表示待測物的濃度較低。 如果所計量到的結合物放射活性較低，則表示待測物的濃度較高。 藉由標準 曲線圖的分析，可以推算出待測物的濃度。 25用 ELISA 法及 RIA 法檢測26活性蛋白及其降解產(chǎn)物的測定27血漿纖維蛋白原水平與纖維蛋白 體聚合功能的測定28血漿纖維蛋白原降解產(chǎn)物測定參考值 5mg/L 意 義 1.增高見于原發(fā)性纖溶癥,DIC(彌散性血管內(nèi)凝血),惡性腫瘤,肝臟疾病,腎臟疾病,肺梗死,白血病,器官移植的排斥反應等.29血漿纖維蛋白原降解產(chǎn)物測定原理 將

12、FDPs單抗色酸干酶標板,加入受檢血清,血清中FDPs(抗原)與包被在反應板的FDPs單抗結合,然后再加入酶標記的FDPs抗體,與包被的FDPs結合,最后加入底物顯色,顯色深淺與血清中FDPs含量成正相關,所得的A值可從標準曲線中計算出血清中FDPs的含量.30炎癥細胞因子在眾多炎癥細胞因子中，起主要作用的是TNF- 、IL-1、IL-6、TGF-、IL-8、IL-l0等。 TNF-是炎癥反應過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促使其他細胞因子的合成和釋放。 IL一6能誘導B細胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導T細胞活化增殖、分化

13、，參與機體的免疫應答，是炎性反應的促發(fā)劑。 IL-8能刺激中性粒細胞、T淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的趨化，促進中性粒細胞脫顆粒，釋放彈性蛋白酶，損傷內(nèi)皮細胞，使微循環(huán)血流淤滯，組織壞死，造成器官功能損傷。 31生物活性法兒測定驗證因子具體舉例白介素-2(17到24張)32本法系根據(jù)在不同白介素-2 (IL-2)的濃度下，其細胞依賴株CTLL-2細胞存活率不同，以此檢測IL-2的生物學活性。 人白介素-2生物學活性測定法(CTLL-2細胞/MTT比色法) 33試劑(1) RPMI1640培養(yǎng)液 取RPMI 1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋至1000ml，加青霉素105IU和鏈霉素

14、105 IU，再加碳酸氫鈉2.1g，溶解后，混勻，除菌過濾，4保存。(2) 基礎培養(yǎng)液 取新生牛血清(FBS) 10ml，加 RPMl 1640培養(yǎng)液90ml。4保存。(3)完全培養(yǎng)液 取基礎培養(yǎng)液100ml，加重組人自介素-2至終濃度400800IU。4保存。34(4) PBS 取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至1000ml，經(jīng)121 15分鐘滅菌。(5)噻唑藍(MTT)溶液 取MTT 0.1g，加PBS溶解并稀釋成20ml，經(jīng)0.22pm濾膜過濾除菌。4避光保存。(6)裂解液 15十二烷基硫酸鈉溶液，使用期限不得超過12個月。C

15、TLL-2細胞 應為偏酸性、略微渾濁液體，傳代后4860小時用于重組人白介素-2生物學活性測定。 35標準品溶液的制備 取重組人白介素-2生物學活性測定的國家標準品，按使用說明書復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋至每lml含200IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中，做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2個孔。每孔分別留50ul標準品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下進行。 36供試品溶液的制備 將供試品按標示量復溶后，用基礎培養(yǎng)液稀釋成每lml約含200IU。在96孔細胞培養(yǎng)板中。做2倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度做2孔。每孔分別留50ul供試品溶液，棄去孔中多余溶液。以上操作在無菌條件下

16、進行。 37測定法 CTLL-2細胞用完全培養(yǎng)液于37、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)至足夠量，離心收集CTLL-2細胞，用 RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于基礎培養(yǎng)液中配制成每lml含6.O105個細胞的細胞懸液，置37、5二氧化碳條件下備用。在加有標準品溶液和供試品溶液的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液50ul，于37、5二氧化碳培養(yǎng)1824小時。 38然后每孔加入 MTT溶液20ul，于37、5二氧化碳培養(yǎng)46小時后，每孔加入裂解液150ul，于37、5二氧化碳條件下保溫1824小時。以上操作均在無菌條件下進行?；靹蚣毎逯械囊后w，放入酶標儀，以630nm為參比波長，于波長570

17、nm處測定吸光度，記錄測定結果。試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算試驗結果： 39 DsEs 供試品生物學活性(IU/m1) = Pr DrEr式中：Pr為標準品生物學活性，IUml； Ds為供試品預稀釋倍數(shù)； Dr為標準品預稀釋倍數(shù)； Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋 倍數(shù)； Er為標準品半效稀釋倍數(shù)。40基因測定測定基因可以更有力的說明基因表達的內(nèi)源性活性物質(zhì)的存在411、PCR技術測基因2、運用熒光探針測定基因（原理見前述）3、免疫組織化學染色法（原理見前述）42RNA的測定43小分子化學物質(zhì)的檢測441、液質(zhì)連用 液質(zhì)聯(lián)用（HLPC-MS）又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與