本科《食品生物技術(shù)導(dǎo)論》課件第二章（2） 乙烯分子生物學(xué)與基因工程-

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室果蔬采后篇主講教師： 朱本忠2002 年 9 月乙烯分子生物學(xué)與基因工程中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展以增加農(nóng)作物抗性和耐貯性的轉(zhuǎn)基因植物源食品。以改善食品品質(zhì)、增加食品營(yíng)養(yǎng)為主要特征的轉(zhuǎn)基因食品。以研究增加食品中功能因子和免疫功能的轉(zhuǎn)基因食品第一代第二代第三代中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第一代轉(zhuǎn)基因食品抗除草劑基因：抗草甘膦 CP4-EPSPS，抗草胺膦Bar，Pat，GOX基因玉米，棉花，油菜，甜菜，大豆，水稻抗蟲基因：Bt系列：CrylAb,CRY1Ac,Cry3A,Cry9C等玉米，棉花，番茄，馬鈴薯延遲成熟基因：

2、反義ACS，反義ACO，PG，SAM水解酶，ACC脫氨酶番茄，甜瓜中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第二代轉(zhuǎn)基因食品新增營(yíng)養(yǎng)因子Dupont公司的高油酸大豆油。油脂改良瑞士的富含VitaminA前體的轉(zhuǎn)基因水稻蛋白質(zhì)改良高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米，高面筋蛋白小麥果蔬品質(zhì)改良抗加工褐變的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第三代轉(zhuǎn)基因食品乙肝疫苗番茄、馬鈴薯、煙草、羽扇豆、萵苣大腸桿菌腸毒素疫苗煙草和馬鈴薯霍亂病毒疫苗馬鈴薯輪狀病毒疫苗番木瓜諾瓦克病毒疫苗煙草和馬鈴薯結(jié)核病疫苗煙草、黃瓜、番茄和胡蘿卜狂犬病疫苗番茄中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室耐貯轉(zhuǎn)基因果蔬和保鮮（實(shí)踐）果蔬

3、采后生物技術(shù)乙烯分子生物學(xué)采后生理機(jī)制（理論）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯成熟生理（躍變類果實(shí)）1. 刺激呼吸高峰2. 啟動(dòng)成熟衰老3. 促進(jìn)成熟基因表達(dá)變化4. 啟動(dòng)系統(tǒng)II乙烯生成中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯成熟生理（非躍變類果實(shí)）1. 促進(jìn)果實(shí)呼吸2. 葉綠素破壞、組織軟化3. 刺激采后基因表達(dá)4. 促進(jìn)系統(tǒng)I乙烯生成葉綠素和類囊體降解類胡卜素合成細(xì)胞壁代謝變化香味物質(zhì)合成呼吸躍變楊循環(huán)I) 持加基因不變II) 一些基因關(guān)閉III) 成熟相關(guān)基因啟動(dòng)信號(hào)的傳導(dǎo)受體感受信號(hào)乙烯 ACCSAM乙烯生理作用調(diào)控模式ACC 脫氨酶ACC 氧化酶ACC 合成酶乙烯合成自

4、身催化刺激基因表達(dá)蛋氨酸中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室METSAMACC乙烯乙烯受體蛋白乙烯各種生理效應(yīng)抑制因子：反義和突變體抑制因子：重金屬，異硫氰酸鹽，重氮基環(huán)戊二烯抑制因子：乙烯清除劑，乙烯吸收劑丙二酰基ACC-丁酮酸鹽反義抑制促進(jìn)因子：促進(jìn)成熟的因子，生長(zhǎng)素，脅迫及外源乙烯等ACC合酶抑制因子：AVG，AOA促進(jìn)因子：外源乙烯等ACC氧化酶反義抑制抑制因子：重金屬，自由基清除劑，高溫，低氧中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯生物合成及其基因工程 1 ） 2）MET SAM ACC C2H4 3） 丁酮酸和氨 1）ACC合酶：限速酶 2）ACC氧化酶 3）ACC脫氨酶基因

5、楊循環(huán)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室關(guān)于乙烯生物合成的基因工程1990年，Hamilton等將ACC氧化酶的反義基因pTOM轉(zhuǎn)入番茄，果實(shí)乙烯被抑制87%。1991年Klee等將ACC脫氨酶基因轉(zhuǎn)入番茄，乙烯被抑制97%，果實(shí)后熟減慢。1991年Oeller等轉(zhuǎn)入反義ACC合酶基因，乙烯合成被抑制99.5%，果實(shí)不能正常成熟。1992年Grerison等將EFE基因轉(zhuǎn)入番茄。1993年湯福強(qiáng)等獲得控制ACC合酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。1994年羅云波等獲得控制ACC合酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因果實(shí)，并對(duì)其采后生理特性進(jìn)行了全面的評(píng)價(jià)。隨后世界各國(guó)展開(kāi)了控制乙烯生物合成的轉(zhuǎn)基因研究工作。中國(guó)農(nóng)業(yè)大

6、學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室為什么選擇番茄作為模式作物對(duì)番茄的染色體圖譜已經(jīng)有了較全面的了解。擁有幾種番茄成熟突變體。已經(jīng)建立了較好的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。番茄成熟階段明顯，直觀上容易判斷其成熟進(jìn)程。（未熟期、綠熟期、破色期、轉(zhuǎn)色期、粉紅期、紅色期）番茄是一種很好的經(jīng)濟(jì)作物：如加工番茄中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒農(nóng)桿菌4404侵染番茄子葉中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技

7、術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究不是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不是結(jié)構(gòu)物質(zhì)不是生化反應(yīng)的直接參與者它是水果蔬菜成熟衰老的信號(hào)分子乙烯：結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的植物激素不是能量物質(zhì)葉綠素和類囊體降解類胡卜素合成細(xì)胞壁代謝變化香味物質(zhì)合成呼吸躍變楊循環(huán)I) 持加基因不變II) 一些基因關(guān)閉III) 成熟相關(guān)基因啟動(dòng)信號(hào)的傳導(dǎo)受體感受信號(hào)乙烯 ACCSAM乙烯生理作用調(diào)控模式ACC 脫氨酶ACC 氧化酶ACC 合

8、成酶乙烯合成自身催化刺激基因表達(dá)蛋氨酸中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯三重反應(yīng)1、抑制下胚軸和根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)2、促進(jìn)下胚軸的橫向生長(zhǎng)3、促進(jìn)頂鉤彎曲度的增加無(wú)乙烯乙烯中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室Normal tomatoNever ripe中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室normalCtr1突變體擬南芥中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯不敏感型突變組成型乙烯反應(yīng)突變etr1,etr2ers1,ein3ein3,ein4ein5,ein6ein7,ain1Nr乙烯反應(yīng)突變分析在外源乙烯存在下也不表現(xiàn)三重反應(yīng)ctr1eto1,eto2,eto3,epinastic在

9、無(wú)外源乙烯存在下也表現(xiàn)三重反應(yīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室雙突變分析？ Ethylene Constitutive insensitive ethylene responseETRCTREINREPONSEC2H4ETR家族CTR1EIN2EIN3 GST1 E4 ERF1 LE-ACO1 其它Chitinase PDF1.2 其它乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 AIR ETHYLENEEIN2CTR1CTR1EIN2EIN2Ethylene responseNon responseactiveinactiveETRETR擬南芥中乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

10、食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄乙烯受體研究LeETR1 AtETR1 Lashbrook et al (1998),Zhou et al （1996a） LeETR2 AtETR1 Lashbrook et al (1998) ，Zhou et al (1996b）NR AtETR1 Lashbrook et al(1998), Wilkinson et al, (1995）Payton et al （1996）LeETR4 AtETR2 Tieman and Klee （1999）LeETR5 AtETR2 Tieman and Klee （1999）L

11、eETR6 Tieman and Klee（2002），Iminishi(2001)文獻(xiàn)（reference）探針基因中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室甜瓜 CS-ETR1; CS-ERS1,CS-ETR2 ( Yamasaki et al. 1999);康乃馨 DC-ERS1，DC-ERS2，DC-ETR1 （Shibuya et al. 2002）花椰菜 BO-ETR1, BO-ETR2 ，BO-ERS （Sugiura M et al. 2002）番木瓜 PeETR1，PeERS1，PeERS2 （Mita,S et al. 2002）采后研究相關(guān)植物中克隆的乙烯受體基因：中國(guó)農(nóng)業(yè)大

12、學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄乙烯受體基因表達(dá)分析1、LeETR1 和 LeETR2在番茄組織中是組成性表達(dá)(Zhou et al., 1996a; Lashbrook et al., 1998) 2、NR也在所有組織中表達(dá)，不過(guò)在成熟果實(shí)和果柄脫落區(qū)表達(dá)增強(qiáng)，并受乙烯和成熟過(guò)程誘導(dǎo)(Wilkinson et al., 1995; Payton et al.,1996; Lashbrook et al., 1998) 3、LeETR4和 LeETR5在繁殖器官里高度表達(dá)而在營(yíng)養(yǎng)組織中低水平表達(dá)(Tieman and Klee, 1999) 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄乙烯受體基

13、因表達(dá)分析（本實(shí)驗(yàn)室）4、在番茄果實(shí)成熟進(jìn)程中，LeETR1和LeETR4基因的表達(dá)變化不明顯，6、轉(zhuǎn)反義ACS番茄果實(shí)中LeETR1和LeETR4的表達(dá)受到明顯的抑制，外源乙烯處理轉(zhuǎn)反義ACS番茄果實(shí)，促進(jìn)兩個(gè)受體基因的表達(dá)。表明果實(shí)中LeETR1和LeETR4的表達(dá)受乙烯的誘導(dǎo)。7、在乙烯生成受抑制的轉(zhuǎn)反義ACS番茄果實(shí)中,NR在各發(fā)育階段各部位中表達(dá)較低，但發(fā)育后期在果實(shí)的果皮及中柱中高水平表達(dá)。8、NR在普通番茄和轉(zhuǎn)反義ACS番茄花中均高水平表達(dá),但表達(dá)模式無(wú)明顯差異。 5、LeETR4在果實(shí)外果皮中表達(dá)水平低于其在輻射壁和中柱的表達(dá)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄乙烯受體

14、轉(zhuǎn)基因分析3、減少NR表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出正常的乙烯敏感性，但增加LeETR4的表達(dá)，NR的減少有LeETR4來(lái)補(bǔ)償（Tieman DM，2000），并且能恢復(fù)never ripe番茄果實(shí)的成熟能力（Rachel M，2000）。 1、反義leETR1番茄植株花瓣脫落延遲，植株大小減小，果實(shí)著色和軟化不變，三重反應(yīng)正常（ Catherine A，2002）2、減少leETR4表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄表現(xiàn)出多重的乙烯敏感癥狀，包括嚴(yán)重的偏上性生長(zhǎng)，增強(qiáng)花的脫落，加速果實(shí)成熟，說(shuō)明LeETR4是明顯的乙烯負(fù)調(diào)節(jié)因子（Tieman DM，2000）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄乙烯受體轉(zhuǎn)基因分

15、析（本實(shí)驗(yàn)室）1、轉(zhuǎn)反義NR基因植株分枝數(shù)明顯的減少，莖節(jié)間變長(zhǎng)，果實(shí)轉(zhuǎn)紅期和完熟期比普通番茄果實(shí)要長(zhǎng)。2、轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜透性、蒸騰作用和氣孔導(dǎo)度比野生型植株都要明顯增強(qiáng)，但呼吸作用低于野生型。 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄CTR研究1、TCTR1 Zegzouti H等，1999 2、TCTR2 Lin,Z等，19983、TCTR3 本實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄CTR表達(dá)分析（本實(shí)驗(yàn)室）1、在不同成熟階段、不同成熟部位、不同成熟模式番茄果實(shí)中，TCTR1基因表達(dá)具有明顯的成熟過(guò)程誘導(dǎo)特性，與果實(shí)的成熟度表現(xiàn)出正相關(guān) 。2、TCTR2的表達(dá)水平與成熟度呈

16、負(fù)相關(guān)，隨著成熟度的增加TCTR2基因的表達(dá)水平不斷降低。3、果實(shí)中TCTR1的表達(dá)表現(xiàn)出與乙烯合成類似的變化，并且受乙烯處理誘導(dǎo)表達(dá)。4、TCTR2基因在乙烯生成量最低的未熟階段表達(dá)量最高，并且隨著乙烯的生成量增加，TCTR2基因的表達(dá)也不斷下降；乙烯處理能抑制TCTR2基因的表達(dá)，而抑制乙烯的作用卻促進(jìn)TCTR2基因表達(dá)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄CTR轉(zhuǎn)基因分析（本實(shí)驗(yàn)室）1、轉(zhuǎn)反義TCTR3番茄葉片乙烯生成受到明顯的抑制。2、轉(zhuǎn)反義TCTR3番茄果實(shí)成熟期提前一周左右。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核事件(Roberto Solano, et

17、 al .1998)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄EIN3研究1、LeEIL/1/2/3 (EIN3-like): Denise M. Tieman等，20012、 LeEIL4 (EIN3-like): 本實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄EIN3研究（本實(shí)驗(yàn)室）Le-EIL1 在番茄果實(shí)不同發(fā)育階段和不同處理?xiàng)l件下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的組成型表達(dá)特性，以穩(wěn)定的高水平表達(dá)，說(shuō)明它可能是在其它發(fā)育階段或其它組織中發(fā)揮作用，或者是作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控乙烯相關(guān)反應(yīng)；Le-EIL2的表達(dá)與乙烯及果實(shí)成熟表現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，說(shuō)明它在轉(zhuǎn)錄水平上也參與了果實(shí)成熟過(guò)程中的

18、乙烯信號(hào)傳遞與乙烯反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是一個(gè)成熟相關(guān)基因；Le-EIL3在番茄果實(shí)不同發(fā)育階段和不同處理?xiàng)l件下都以穩(wěn)定的低水平表達(dá)，它可能是作為L(zhǎng)e-EILs基因家族的冗余基因參與乙烯信號(hào)的傳遞，或者是參與其它方面的調(diào)控。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室番茄EIN3轉(zhuǎn)基因分析1、LeEIL/1/2/3表達(dá)都能恢復(fù)擬南芥ein3-1突變體的表型。2、減少LeEIL/1/2/3 的表達(dá)能顯著的降低乙烯敏感性，包括葉片偏上性、花的脫落與衰老、果實(shí)成熟等（Denise M. Tieman等，2001）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室堿變性漂洗生長(zhǎng)著轉(zhuǎn)化菌落的平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜80烘烤具DNA印 跡的膜顯示陽(yáng)性噬菌斑的X光片挑取陽(yáng)性噬菌斑cDNA文庫(kù)篩選雜交放射自顯影保留原平板中和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室LeERF1： 1041bp（Genbank Accession Number AY07