實習——經(jīng)口急性毒性實驗

1、衛(wèi)生毒理學與衛(wèi)生化學學系2013.10.15實習一 經(jīng)口急性毒性實驗一、實驗目的（一）通過本次實驗掌握經(jīng)口灌胃技術，半數(shù)致死劑量的意義。（二）通過本次實驗學習半數(shù)致死劑量的計算及毒性判定。二、測定方法本實驗以灌胃方式測定敵敵畏DDV（80g/100ml）的半數(shù)致死量（LD50）。（一）實驗動物與分組：首選健康成年小鼠（18g22g）和大鼠（180g 220g）。實驗前動物要在實驗環(huán)境中適應3 5 d 時間，以了解其正?；顒忧闆r和健康狀況，并淘汰不健康或體重不符合要求的動物 。本次實驗取體重18 22 g 的小鼠，實驗時，將小鼠稱體重、編號、按隨機分組原則，將實驗動物分成5組，每組8只。（二）劑

2、量選擇首先查閱與受試化學物結構及理化性質(zhì)相近似的化學物的LD50，以此值作為受試化學物的預期毒性中值，即中間劑量組，再上下各推1 2 個劑量組，進行預實驗。各劑量組的間距可根據(jù)LD50 計算方法要求按等比級數(shù)或等差級數(shù)安排。本實驗用機率單位法計算LD50，要求按等比級數(shù)排列，常用1：0.8，如敵敵畏的最高劑量為125 mg/kg，其次劑量組為125 mg/kg *0.8 = 100 mg/kg ，依次類推為80 、64 和51.2 mg/kg五個劑量組。（三）受試化學物配制與稀釋 1. 溶劑： 水溶性受試化學物以蒸餾水為溶劑配制成溶液。脂溶性受試化學物以吐溫-80、二甲基亞砜、植物油等配制。

3、（三）受試化學物配制與稀釋2. 受試物的稀釋等容量稀釋法：各個劑量組的動物均給予相同單位體重體積的受試化學物，按照事先設計的劑量分別稀釋配制為幾種不同的濃度的受試物溶液。例如本次實驗五個劑量組:各劑量組動物給予相同單位體重體積受試物均為10ml/kg。等容量稀釋法D：設計的染毒劑量， mg/kg V：動物給藥量（相同單位體重體積）均為10ml/kgX：各組需配制的受試物溶液的濃度（mg/ml）如：第一組染毒劑量D = 51.2 mg/kg，動物按V = 10 ml/kg體重給藥，配制的受試物濃度為X = 51.2 mg/10ml，依次類推：五個組所需配制的受試物濃度分別為第一組：51.2 mg

4、/10ml第二組： 64 mg/10ml第三組： 80 mg/10ml第四組： 100 mg/10ml第五組： 125 mg/10ml各劑量組小鼠灌胃容量計算:小鼠灌胃容量V ml = 體重（g）10 ml/1000 g各劑量組小鼠染毒劑量:小鼠染毒劑量 = V ml 各組的受試物濃度（mg/10ml)（四）灌胃方法：小鼠灌胃法：左手拇指和食指捏住小鼠頭部兩耳后皮膚，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠腹部向上，盡量使其體位垂直，注意使動物的上消化道固定成一直線。右手持連著灌胃導針的注射器，將灌胃針由動物口腔側插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻力消失，

5、即深入至胃部，一般進針深度小鼠2.54cm，隨后將受試物溶液注入。如遇動物掙扎，應停止進針或?qū)⑨槹纬?，千萬不能強行插入，以免穿破食管，甚至誤入氣管，導致動物立即死亡。小鼠一次灌胃體積為10-20ml/kg （五）中毒體征和死亡情況觀察染毒后觀察和記錄中毒體征及出現(xiàn)的時間、死亡數(shù)量和時間及死亡前的特征。高劑量組動物的死亡常很快發(fā)生，染毒后應即刻密切觀察。根據(jù)觀察情況分析中毒特點和毒作用靶器官。觀察的項目包括：（1）中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)：體位異常、叫聲異常、不安、呆滯、痙攣、抽搐麻痹、運動失調(diào)、對外反應過敏或遲鈍； （2）植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔擴大或縮小、流涎或流淚；（3）呼吸系統(tǒng)：鼻孔流液、鼻

6、翼煽動、血性分泌物、呼吸深緩、呼吸過速、仰頭呼吸、；（4）泌尿生殖系統(tǒng)：會陰部污穢、有分泌物、陰道或乳房腫脹；（5）皮膚和毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松、污穢；（6）眼：眼球突出、結膜充血、角膜渾濁、血性分泌物；（7）消化系統(tǒng)：腹瀉、厭食。 三、LD50 計算可采用多種方法測定LD50，有機率單位法、霍恩氏法、寇氏法等，機率單位法能計算出任何反應率水平的劑量，且實驗2-5組均可。機率單位法遵守的要求：1. 劑量按等比級數(shù)排列，相鄰兩劑量組間的比值常用1：0.82. 各實驗組動物數(shù)相等機率單位法計算LD50公式（用五個劑量組時）X3 -為第三個組的劑量對數(shù)（X3 = log 80，80 mg/kg

7、）i-為相鄰兩組劑量比值（以高劑量組為分子）的對數(shù) i = log（125/100）y-為死亡率相應的機率單位（查附表） -為五個劑量組的死亡率相應的機率單位的均 數(shù)。1、2、3、4、5為小劑量組到大劑量組的順序。5.0-為死亡率是50%時所相當?shù)姆磻实臋C率單位LD50的95%可信限 = log-1(X + 1.96 SX ) 四、結果評價根據(jù)實驗動物中毒體征、死亡時間、根據(jù)得出的LD50及受試物的種類，按相應的國家標準或技術規(guī)范中的急性經(jīng)口毒性分級標準對受試物進行毒性定級，判斷受試物的毒性大小。五、注意事項1.灌胃時操作要避免損傷食道或誤入氣管2.正確捉拿動物，防止被咬傷且避免動物損傷3.灌入量計算和操作要準確，否則影響結果4.防止操作者中毒。注意通風，不要把藥品撒到手、臉部皮膚及身體其他部位，操作過程中要小心。六、實驗報告應包括以下內(nèi)容