限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

1、限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用病毒免疫室 1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 30多年前，當(dāng)人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制”病毒生存的辦法則可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。 當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司尋找更多的限制性內(nèi)切酶2限制性內(nèi)切酶的特點 限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來說，它們可以小到如Pvu II（157個氨基酸），也可以比1250個氨基酸的C

2、je I更大 除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn) 在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過250種的特異識別序列。3限制性內(nèi)切酶的主要功能 保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，這一觀點已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機(jī)制的一部分行使其功能。當(dāng)一個沒有限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌被病毒感染時，大部分病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個有限制性內(nèi)切酶的同種細(xì)菌被成功感染的比率顯著下降。出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會起到多重保護(hù)作用；而一個擁有4到5種各自獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶將會使細(xì)胞堅不可摧。 4 限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶（甲基化酶）出現(xiàn)。后者的作用是保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性

3、內(nèi)切酶破壞 限制性內(nèi)切酶和它的搭檔-甲基化酶一起就構(gòu)成了限制-修飾（R-M）系統(tǒng)。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行5限制性內(nèi)切酶的命名 限制性內(nèi)切酶命名的次序如下： A） 用3個字母代表來源的生物（如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens） B） 1個字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株（BamH） C） 1個羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序（BamHI）6限制性內(nèi)切酶的分類 按照亞基組成、酶切位置、識別位點、輔助因子等因素劃分為三大類 I型限

4、制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個亞基的蛋白復(fù)合體。它們在識別位點很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈。盡管I型酶在生化研究中很有意義，但由于不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的電泳條帶，因而不具備實用性。7限制性內(nèi)切酶的分類 II型酶在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過程中各自獨(dú)立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖

5、先。8限制性內(nèi)切酶的分類 III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制-修飾兩種功能的酶。它們在識別位點之外切開DNA鏈，并且要求識別位點是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生確定的切割片段，因而不具備實用價值，也沒有人將其商業(yè)化。9II型限制性內(nèi)切酶的分類（一） 內(nèi)切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I這樣在識別序列中進(jìn)行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。大部分這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoR I識別GAATTC）；而另一些識別不連續(xù)的序列（如Bgl I識別GCCNN

6、NNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3羥基端和一個5磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應(yīng)的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右。10II型限制性內(nèi)切酶的分類（二） IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它們在識別位點之外切開DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右；它們識別連續(xù)的非對稱序列，有一個結(jié)合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。11

7、II型限制性內(nèi)切酶的分類（三） 第三種II型限制性內(nèi)切酶（有時也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶）是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。有些酶識別連續(xù)序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們在N端有一個負(fù)責(zé)切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨(dú)立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)

8、合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。12一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識異切酶消化星號活力13同裂酶： 有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如Hpa和Msp的識別順序都是5CCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶（同切酶或異源同工酶）。 同裂酶和同尾酶：14 有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能

9、會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如Xba (TCTAGA)、Nhe (GCTAGC） 、Spe (ACTAGT)切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即 Bfa （CTAG) 的酶切位點。同尾酶：15限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用克?。ㄓ袝r與甲基化酶聯(lián)用）鑒定（基因片斷大小、正反向）檢測突變 （識別位點，限制酶切圖譜的多態(tài)性） 制作Marker1617單酶切與雙酶切的選擇策略運(yùn)用載體的限制載體的自身環(huán)化（挑選陽性克隆的工作量）克隆的方向（鑒定）18InsertEcoR1Xho11.9kb質(zhì)粒19該實驗用質(zhì)粒pCMV

10、-Myc-T10經(jīng)EcoR單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoR和Xho雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA片段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb（如下圖）。3.06.0EcoRIEcoRI&XhoIDNA Marker2.03.81.95.720 限制性片段長度多態(tài)性 RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms) 1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖，500多個RELP 位點，定位了Huntington病，CF（囊性纖維化）和癌相關(guān)基因（APC，DCC 等）21RFLP在遺傳病檢測中的應(yīng)用 鐮狀細(xì)胞貧血癥（ globin，6 ），其GAGGTG的

11、突變，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP檢出。 甲型血友病（FVIII，XR）可用PCR-RFLP檢出。142 bp 99 bp22 引起鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥的原因就是基因的點突變，即編碼血紅蛋白肽鏈上一個決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。肽鏈基因上單個核苷酸的替換AU恰好使該基本片段丟失了可被Mst II或Cvn切開的一個限制性內(nèi)切酶位點。由于基因突變改變了限制性酶切的結(jié)果，用Southern blot分析方法和限制性片段長度多態(tài)性（簡稱RFLP）分析方法即可對鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥胎兒做產(chǎn)前

12、診斷，或?qū)Πl(fā)病家族成員的基因組型進(jìn)行分析。 23240.5 g的1kb DNA Ladder 0.8%TAE瓊脂糖凝膠，EB染色 25數(shù)據(jù)庫 限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫/rebase 其中含有已知的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)。26應(yīng)用中的注意點1、建立一個標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng) 目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個單位的內(nèi)切酶可以切割1g不同來源和純度的DNA。通常，一個50l的反應(yīng)體系中，1l的酶在1X Buffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時即可降解1g已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時間；如果減少酶的用量，對許多酶來說，相應(yīng)延

13、長反應(yīng)時間（不超過16小時）也可完全反應(yīng)。 一般說來，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1ug lambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。272、選擇正確的酶 不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個相應(yīng)的識別位點。識別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個GC含量50%的DNA鏈，一個識別4個堿基的酶將平均在每44（256）個堿基中切割一次；而一個識別6個堿基的酶將平均在每46（4096）堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)

14、物都可以互相連接283、加酶 內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。294、DNA 待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素305、緩沖液 對于每一種酶都提供相應(yīng)的最佳緩沖液，可保證酶活性。使用時的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100g/ml的BSA以實現(xiàn)最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響316、 反應(yīng)體積 內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時內(nèi)，50l反應(yīng)體積

15、中，降解1g的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶：DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）327、混合 這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！338、反應(yīng)溫度 大部分酶的反應(yīng)溫度為37；從嗜熱菌中分離出來的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65不等349、反應(yīng)時間 1酶活單位的定義時間為1小時。如果加入的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時間；

16、反之，如果加入的酶量較少，也可以延長時間以使反應(yīng)達(dá)到完全3510、終止反應(yīng) 如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來終止反應(yīng)。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍(lán)（10l/50l反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（65或85，20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。3611、貯存 大部分酶應(yīng)貯存于-20。少部分酶則須在-70長期保存。10X BUFFER 和100X BSA于-20保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存，否則將會出現(xiàn)BSA沉淀3712、穩(wěn)定性 每隔1-2

17、個月都會對所有的酶有一個活性檢測；最近的一次檢測結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20條件下十分穩(wěn)定。高于-20條件下穩(wěn)定性將有所降低3813、對照反應(yīng) 如果發(fā)現(xiàn)DNA底物不能被成功切開，可以進(jìn)行對照實驗以查明原因。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對照DNA（有多個已知酶切位點）同時進(jìn)行反應(yīng)。若實驗結(jié)果表明底物DNA降解，則說明DNA在純化過程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對照DNA被成功切開，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時可以將對照DNA和待切底物DNA混合起來再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對照DNA也無法被切開39使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟A）測試酶切DNA的量B）計算完全酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%，計算能加的酶量，最多能加終體積的10%（甘油的濃度為5%）。C）10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10；10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。D）加入計算好的DNA，10X反應(yīng)液，酶。加入水到終體積（20-50 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤亍Ｒ话忝傅淖钸m溫度為37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說明。40舉例質(zhì)粒DNA （2ug/ ul） 5 ul10X反應(yīng)液 5