利用InDel分子標(biāo)記輔助選育辣椒抗黃瓜花葉病毒病種質(zhì)

1、利用InDei分子標(biāo)記輔助選育辣椒抗黃瓜花葉病毒病種質(zhì)作者：郭廣君朱雪梅潘寶貴刁衛(wèi)平劉金兵高長洲王述彬來源：江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報2021年第05期a:PUC688、G29植株；b:P13C688/；29和1代的果實o圖1高抗黃瓜花葉病毒CNW種質(zhì)灌木狀辣椒PBC688(C.frutencensci,PBC688)和高感CMV種質(zhì)Gannuumcv.G29Fig.lGermplasmofCfrutencenscv.PBCfiSSndCamiuumcv.G29250bp100bp250bp100bp250bp100bpM：Marker；166：33個耳代株系，每個株系2個單株圖23個InDel分子標(biāo)記在部

2、分F&代株系中的擴増情況Fig.2PCRamplificationofthreeInlelmolecularmarkersinsomelinesofF6population表1F6代自交系的分子標(biāo)記組合及果實性狀Table1MolecularmarkercombinationandfmittraitsofF6inbredlines分子標(biāo)記組合果實性狀序號種質(zhì)編呂lnl)rl-2-/54inl)e|.2-/4lnl)el-2-/52果形單果質(zhì)雖(g)果實縱徑(cm)果實橫徑(6-1346.67R00H6-1486.67K00H6-1783.70HR00H6-2165.19R()0H6-21710

3、.37K00心2197.41R00H6-22()1.48HR00H6-2226.67K00H6-2245.93K00H6-2258.15R00H6-22611.85R00IL-22818.52R00續(xù)表2Continued工抗CMV接種鑒定分F標(biāo)記組合種質(zhì)編號病情指數(shù)門増抗性ln(Jel-2ZJ4aVh-2-!401叫亠2402.22HK00H嚴(yán)4.44HK00平均S.I8H申14.07R221時6412.5?R22H&Z17.04R22仏-氐25A922H6-l&525.93TIR22%如25.19MR22H.-2J427.41Mil2217.04K2225,19MK72平均23.0727.

4、4JMR12Hb-2IO31.S3MK02H嚴(yán)1.48Hit?0平均20.25PBC688抗病對照）2.22HR00感病対照）45.19s11病情擂數(shù)（圍）=E（病略該病級株數(shù)）/（弱總株數(shù)）x10（）免疫:DUD；高抗：040.0.S；感病溷R沖抗；R:抗?。籋R：高抗。0：純合杭病型；】：址合感病型憶:雜合型摘要：黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）是危害中國辣椒生產(chǎn)的第一大病毒，創(chuàng)制抗性育種材料、培育抗性品種是防治CMV最有效的方法。以高抗CMV材料PBC688為母本，與感病甜椒材料G29為父本雜交，通過連續(xù)自交獲得F6代自交系。利用與抗性基因qCmr2.1緊密

5、連鎖的3個InDei分子標(biāo)記，結(jié)合人工接種鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查對109個株系進(jìn)行篩選。分子標(biāo)記鑒定結(jié)果顯示，攜帶純合抗性片段的株系有28個，攜帶純合感病片段的株系有65個，攜帶雜合片段的株系有16個，雜合率為14.7%。農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果顯示，大部分?jǐn)y帶qCmr2.1基因的自交系果實較小，首花節(jié)位高，花期和成熟期顯著晚于感病材料G29。篩選到1份高抗CMV且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的育種材料H6-223，人工接種鑒定結(jié)果顯示，21個純合抗病型對CMV表現(xiàn)為高抗、抗;在14個純合感病型中，13個株系表現(xiàn)為感病，1個株系表現(xiàn)為中抗;9個雜合型株系的抗病性出現(xiàn)分離，表現(xiàn)為抗、中抗;3個在分子標(biāo)記間出現(xiàn)重組的自交系中

6、，H6-223表現(xiàn)為高抗，另外2個表現(xiàn)為中抗。由研究結(jié)果可以看出，3個InDei分子標(biāo)記可以輔助創(chuàng)制辣椒抗CMV種質(zhì)，創(chuàng)制的高抗CMV且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質(zhì)H6-223可進(jìn)一步用于辣椒抗CMV育種。關(guān)鍵詞：辣椒;黃瓜花葉病毒;分子標(biāo)記輔助選育中圖分類號：S436.418.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440(2021)05-1251-11InnovationofpeppergermpiasmresourcewithresistancetocucumbermosaicvirusbyInDeimoiecuiarmarkerassistedseiectionGUOGuang-jun1，ZH

7、UXue-mei1，2，PANBao-gui1，DIAOWei-ping1，LIUJin-bing1，GAOChang-zhou1，WANGShu-bin1(1.InstituteofVegetabieCrops，JiangsuAcademyofAgricuituraiSciences/JiangsuKeyLaboratoryforHorticuituraiCropGeneticImprovement，Nanjing210014，China;2.CoiiegeofHorticuiture，NanjingAgricuituraiUniversity，Nanjing210095，China)Abs

8、tract：Cucumbermosaicvirus(CMV)isthemostseriousvirusthreateningtheproductionofpepperinChina.InnovationofpeppergermpiasmresourcesandbreedingvarietieswithresistancetoCMVisthemosteffectivemethodtopreventCMV.UsingtheresistantmateriaiPBC688asfemaieparentandthesusceptibiesweetpepperG29asmaieparent，F(xiàn)6inbred

9、iineswereobtainedthroughsuccessiveinbreedinginthisstudy.Totaiiy109F6inbrediineswereidentifiedbythreeInDeimarkerstightiyiinkingtoqCmr2.1.ThepeppergermpiasmswithresistancetoCMVwerechosenbycombiningwiththeartificiaiinocuiationidentificationandtheinvestigationofagronomictraits.Theresuitsofmoiecuiarmarke

10、ridentificationshowedthattherewere28iinescarryinghomozygousresistantfragment，65iinescarryinghomozygoussusceptibiefragment，and16iinescarryingheterozygousfragments.Theheterozygousratewas14.7%.TheinvestigationresuitsofagronomictraitsindicatedthatmostinbrediinescarryingqCmr2.1genehadsmaiierfruits，higher

11、nodepositionofthefirstfiower，andsignificantiyiaterfioweringandripeningthansusceptibiemateriaiG29.AbreedingmateriaiH6-223withhighresistancetoCMVandexceiientagronomiccharacterswasscreened.Theresuitsofartificiaiinocuiationidentificationindicatedthat21diseaseresistantmateriaiswithhomozygousgenotypesshow

12、edhighresistanceorresistancetoCMV.The13iineswithhomozygoussusceptibiefragmentweresusceptibietoCMVandoneiinewasmiddieresistancetoCMV.TheresistancetoCMVofnineiineswithheterozygousgenotypeswasseparatedproportionaiiy.Amongthethreeinbrediineswithrecombinantmoiecuiarmarkers，H6-223showedhighresistanceandth

13、eothertwoshowedmoderateresistance.Ingenerai，weestabiishedInDeimoiecuiarmarkerassistedseiectionsystemforpepperresistancetoCMV，andinnovatedonegermpiasmH6-223withresistancegeneqCmr2.1andexceiientagronomictraits，whichcouidbeappiiedinbreedingforresistancetoCMVinpepper.Keywords：pepper;cucumbermosaicvirus;

14、molecularmarkerassistedselection黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是世界十大植物病毒之一，可以侵染超過100個科的1200種植物1。劉勇等2調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從辣椒中檢出的33種病毒中，CMV的檢出率高達(dá)20.29%，超過煙草花葉病毒的檢出率(14.64%)而成為危害中國辣椒生產(chǎn)的第一大優(yōu)勢病毒。在辣椒生產(chǎn)過程中，CMV不僅影響產(chǎn)量，而且危害果實品質(zhì)，而培育抗性品種是防治CMV最經(jīng)濟、最有效的方法，也是中國辣椒抗病育種的主要目標(biāo)。國內(nèi)外育種家通過抗性轉(zhuǎn)育，已經(jīng)育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品種，但高抗CMV的品種稀缺。由于很多新CMV病毒株

15、系可突破原有抗性，導(dǎo)致現(xiàn)有品種已無法滿足產(chǎn)業(yè)需求。鑒定和轉(zhuǎn)育新的抗CMV基因或?qū)⒍鄠€抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗品種稀缺最有效的方法。目前，人們已經(jīng)從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關(guān)的數(shù)量性狀座位(Quantitativetraitlocus，QTL)和基因，除單顯性基因Cmr1外，其他抗性基因均未得到轉(zhuǎn)育應(yīng)用5。傳統(tǒng)育種技術(shù)通過雜交和回交進(jìn)行抗性基因轉(zhuǎn)育，通過田間鑒定或人工接種鑒定進(jìn)行抗性單株的篩選，耗時長、效率低?，F(xiàn)代育種技術(shù)可以通過分子標(biāo)記輔助選擇(Markerassistedselection，MAS)技術(shù)實現(xiàn)抗性基因的快速積累6-7。近年來，高通量基因

16、分型結(jié)合新一代測序技術(shù)可快速檢測與抗病基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，大大縮短了高密度圖譜構(gòu)建、QTL位點分析和候選基因鑒定所需的時間8-10。隨著分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的完善和標(biāo)記類型的增多，越來越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。Barka等11對辣椒上真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等引起的相關(guān)病害的抗性基因連鎖標(biāo)記開發(fā)和抗性基因克隆進(jìn)行了總結(jié)分析。李寧等12根據(jù)已有文獻(xiàn)公布的抗病分子標(biāo)記對209份辣椒資源進(jìn)行了抗病基因檢測，明確了供試種質(zhì)的抗性基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所利用種間雜交、回交和分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)創(chuàng)制出辣椒抗番茄斑萎病病毒的育種材料0516Tsw1

17、3，育成了首個抗番茄斑萎病病毒(TSWV)的甜椒品種中椒115號14。綜上所述，采用分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)能夠快速鑒定種質(zhì)資源的抗性基因，分子標(biāo)記輔助回交可以提高抗性基因轉(zhuǎn)育和抗病育種材料的創(chuàng)制效率，加快辣椒抗病育種的進(jìn)程。本課題組前期在辣椒抗源材料灌木狀辣椒PBC688(Capsicumfrutescenscv.PBC688)的2號染色體上定位到1個抗CMV的主效QTL(qCmr2.1)，并開發(fā)出3個與qCmr2.1緊密連鎖的InDei分子標(biāo)記15?？乖床牧螾BC688的果實極小，果實呈橢圓形，單果質(zhì)量僅為1.0g左右，在江蘇地區(qū)側(cè)枝多、首花節(jié)位高，花期和成熟期晚，無法直接用于抗CMV育種。感

18、病材料C.annuumcv.G29坐果性好，果形為長燈籠形，單果質(zhì)量約為50g，首花節(jié)位低，花期和成熟期早，是一個優(yōu)良的甜椒育種材料(圖1)。據(jù)此，利用PBC688與G29進(jìn)行種間雜交，將抗性基因qCmr2.1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)育，創(chuàng)制新的高抗CMV且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質(zhì)材料。本研究利用上述3個InDei分子標(biāo)記對創(chuàng)制的F6代自交系進(jìn)行輔助篩選，結(jié)合人工接種鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查，檢驗抗性基因的轉(zhuǎn)育效率，以期篩選高抗CMV的育種材料。1材料與方法試驗材料母本材料為高抗CMV的C.frutencenscv.PBC68&父本材料為高感CMV的甜椒材料G29。2013年通過父母本種間雜交獲得F1代雜種(圖1),連

19、續(xù)自交5代，2020年6月獲得109個F6代高代自交系材料。每個自交系選取2株代表1個自交系的遺傳信息，單株留種作為F7代，用于抗CMV效果的人工接種鑒定。1.2試驗方法2020年2-7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地對F6代株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查和留種；4-6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實驗室對F6代株系進(jìn)行分子標(biāo)記檢測；8-10月在實驗室用部分F7代株系進(jìn)行抗CMV效果的人工接種鑒定。DNA提取基因組DAN提取使用DNA提取試劑盒(Cat#DP3112，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，按照說明書要求逐步提取DNA。使用1%瓊脂糖凝膠和NanoDropOne(ThermoScienti

20、fic)檢測DNA的質(zhì)量和質(zhì)量濃度，調(diào)整DNA的質(zhì)量濃度為40ng/yl。InDel分子標(biāo)記輔助篩選抗CMV基因qCmr2.1用于抗CMV基因輔助篩選的3對InDel分子標(biāo)記的引物分別為InDel-2-134-F(5，-TGCTTCAGTTGAGTTGTCCA3)+InDel-2134-R(5-TAAATCCCCTTGTGGTGGCT-3)、InDel-2-140-F(5-GGTTGGTTAGCATGGGTGTG-3)+InDel-2-140-R(5-CGAAACCGAACCGTTAAAGAC-3)、InDel-2-151-F(5-ACCCACGACTTAAACTCAAAACT-3)+InDe

21、l-2-151-R(5-TCAAGAGAGAAATAGTGATGCCA-3)。Keywords：pepper；cucumbermosaicvirus；molecularmarkerassistedselection黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是世界十大植物病毒之一，可以侵染超過100個科的1200種植物1。劉勇等2調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從辣椒中檢出的33種病毒中，CMV的檢出率高達(dá)20.29%，超過煙草花葉病毒的檢出率(14.64%)而成為危害中國辣椒生產(chǎn)的第一大優(yōu)勢病毒。在辣椒生產(chǎn)過程中，CMV不僅影響產(chǎn)量，而且危害果實品質(zhì)，而培育抗性品種是防治CMV最經(jīng)濟、最有效的方

22、法，也是中國辣椒抗病育種的主要目標(biāo)。國內(nèi)外育種家通過抗性轉(zhuǎn)育，已經(jīng)育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品種，但高抗CMV的品種稀缺。由于很多新CMV病毒株系可突破原有抗性，導(dǎo)致現(xiàn)有品種已無法滿足產(chǎn)業(yè)需求。鑒定和轉(zhuǎn)育新的抗CMV基因或?qū)⒍鄠€抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗品種稀缺最有效的方法。目前，人們已經(jīng)從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關(guān)的數(shù)量性狀座位（Quantitativetraitlocus,QTL）和基因，除單顯性基因Cmrl外，其他抗性基因均未得到轉(zhuǎn)育應(yīng)用5。傳統(tǒng)育種技術(shù)通過雜交和回交進(jìn)行抗性基因轉(zhuǎn)育，通過田間鑒定或人工接種鑒定進(jìn)行抗性單株的篩選，耗時長、效率

23、低?，F(xiàn)代育種技術(shù)可以通過分子標(biāo)記輔助選擇Markerassistedselection,MAS）技術(shù)實現(xiàn)抗性基因的快速積累6-7。近年來，高通量基因分型結(jié)合新一代測序技術(shù)可快速檢測與抗病基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，大大縮短了高密度圖譜構(gòu)建、QTL位點分析和候選基因鑒定所需的時間8-10。隨著分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的完善和標(biāo)記類型的增多，越來越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。Barka等11對辣椒上真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等引起的相關(guān)病害的抗性基因連鎖標(biāo)記開發(fā)和抗性基因克隆進(jìn)行了總結(jié)分析。李寧等12根據(jù)已有文獻(xiàn)公布的抗病分子標(biāo)記對209份辣椒資源進(jìn)行了抗病基因檢測

24、，明確了供試種質(zhì)的抗性基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所利用種間雜交、回交和分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)創(chuàng)制出辣椒抗番茄斑萎病病毒的育種材料0516Tsw13，育成了首個抗番茄斑萎病病毒（TSWV）的甜椒品種中椒115號14。綜上所述，采用分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)能夠快速鑒定種質(zhì)資源的抗性基因，分子標(biāo)記輔助回交可以提高抗性基因轉(zhuǎn)育和抗病育種材料的創(chuàng)制效率，加快辣椒抗病育種的進(jìn)程。本課題組前期在辣椒抗源材料灌木狀辣椒PBC688（Capsicumfrutescenscv.PBC688）的2號染色體上定位到1個抗CMV的主效QTL（qCmr2.1），并開發(fā)出3個與qCmr2.1緊密連鎖的InDei分子標(biāo)記15

25、?？乖床牧螾BC688的果實極小，果實呈橢圓形，單果質(zhì)量僅為1.0g左右，在江蘇地區(qū)側(cè)枝多、首花節(jié)位高，花期和成熟期晚，無法直接用于抗CMV育種。感病材料C.annuumcv.G29坐果性好，果形為長燈籠形，單果質(zhì)量約為50g，首花節(jié)位低，花期和成熟期早，是一個優(yōu)良的甜椒育種材料（圖1）。據(jù)此，利用PBC688與G29進(jìn)行種間雜交，將抗性基因qCmr2.1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)育，創(chuàng)制新的高抗CMV且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質(zhì)材料。本研究利用上述3個InDei分子標(biāo)記對創(chuàng)制的F6代自交系進(jìn)行輔助篩選，結(jié)合人工接種鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查，檢驗抗性基因的轉(zhuǎn)育效率，以期篩選高抗CMV的育種材料。1材料與方法試驗材料母本材料

26、為高抗CMV的C.frutencenscv.PBC68&父本材料為高感CMV的甜椒材料G29。2013年通過父母本種間雜交獲得F1代雜種（圖1），連續(xù)自交5代，2020年6月獲得109個F6代高代自交系材料。每個自交系選取2株代表1個自交系的遺傳信息，單株留種作為F7代，用于抗CMV效果的人工接種鑒定。1.2試驗方法2020年2-7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地對F6代株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查和留種；4-6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實驗室對F6代株系進(jìn)行分子標(biāo)記檢測；8-10月在實驗室用部分F7代株系進(jìn)行抗CMV效果的人工接種鑒定。DNA提取基因組DAN提取使用DNA提取試劑盒(Cat#

27、DP3112，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，按照說明書要求逐步提取DNA。使用1%瓊脂糖凝膠和NanoDropOne(ThermoScientific)檢測DNA的質(zhì)量和質(zhì)量濃度，調(diào)整DNA的質(zhì)量濃度為40ng/yl。InDel分子標(biāo)記輔助篩選抗CMV基因qCmr2.1用于抗CMV基因輔助篩選的3對InDel分子標(biāo)記的引物分別為InDel-2-134-F(5，-TGCTTCAGTTGAGTTGTCCA3)+InDel-2134-R(5-TAAATCCCCTTGTGGTGGCT-3)、InDel-2-140-F(5-GGTTGGTTAGCATGGGTGTG-3)+InDel-2-140-R(

28、5-CGAAACCGAACCGTTAAAGAC-3)、InDel-2-151-F(5-ACCCACGACTTAAACTCAAAACT-3)+InDel-2-151-R(5-TCAAGAGAGAAATAGTGATGCCA-3)。Keywords：pepper；cucumbermosaicvirus；molecularmarkerassistedselection黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)是世界十大植物病毒之一，可以侵染超過100個科的1200種植物1。劉勇等2調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從辣椒中檢出的33種病毒中，CMV的檢出率高達(dá)20.29%，超過煙草花葉病毒的檢出率(14.

29、64%)而成為危害中國辣椒生產(chǎn)的第一大優(yōu)勢病毒。在辣椒生產(chǎn)過程中，CMV不僅影響產(chǎn)量，而且危害果實品質(zhì)，而培育抗性品種是防治CMV最經(jīng)濟、最有效的方法，也是中國辣椒抗病育種的主要目標(biāo)。國內(nèi)外育種家通過抗性轉(zhuǎn)育，已經(jīng)育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品種，但高抗CMV的品種稀缺。由于很多新CMV病毒株系可突破原有抗性，導(dǎo)致現(xiàn)有品種已無法滿足產(chǎn)業(yè)需求。鑒定和轉(zhuǎn)育新的抗CMV基因或?qū)⒍鄠€抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗品種稀缺最有效的方法。目前，人們已經(jīng)從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關(guān)的數(shù)量性狀座位(Quantitativetraitlocus，QTL)和基因，除單顯性基

30、因Cmr1外，其他抗性基因均未得到轉(zhuǎn)育應(yīng)用5。傳統(tǒng)育種技術(shù)通過雜交和回交進(jìn)行抗性基因轉(zhuǎn)育，通過田間鑒定或人工接種鑒定進(jìn)行抗性單株的篩選，耗時長、效率低?，F(xiàn)代育種技術(shù)可以通過分子標(biāo)記輔助選擇(Markerassistedselection，MAS)技術(shù)實現(xiàn)抗性基因的快速積累6-7。近年來，高通量基因分型結(jié)合新一代測序技術(shù)可快速檢測與抗病基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，大大縮短了高密度圖譜構(gòu)建、QTL位點分析和候選基因鑒定所需的時間8-10。隨著分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的完善和標(biāo)記類型的增多，越來越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。Barka等11對辣椒上真菌、細(xì)菌、病毒

31、和線蟲等引起的相關(guān)病害的抗性基因連鎖標(biāo)記開發(fā)和抗性基因克隆進(jìn)行了總結(jié)分析。李寧等12根據(jù)已有文獻(xiàn)公布的抗病分子標(biāo)記對209份辣椒資源進(jìn)行了抗病基因檢測，明確了供試種質(zhì)的抗性基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所利用種間雜交、回交和分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)創(chuàng)制出辣椒抗番茄斑萎病病毒的育種材料0516Tsw13，育成了首個抗番茄斑萎病病毒(TSWV)的甜椒品種中椒115號14。綜上所述，采用分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)能夠快速鑒定種質(zhì)資源的抗性基因，分子標(biāo)記輔助回交可以提高抗性基因轉(zhuǎn)育和抗病育種材料的創(chuàng)制效率，加快辣椒抗病育種的進(jìn)程。本課題組前期在辣椒抗源材料灌木狀辣椒PBC688(Capsicumfrutesc

32、enscv.PBC688)的2號染色體上定位到1個抗CMV的主效QTL(qCmr2.1)，并開發(fā)出3個與qCmr2.1緊密連鎖的InDei分子標(biāo)記15?？乖床牧螾BC688的果實極小，果實呈橢圓形，單果質(zhì)量僅為1.0g左右，在江蘇地區(qū)側(cè)枝多、首花節(jié)位高，花期和成熟期晚，無法直接用于抗CMV育種。感病材料C.annuumcv.G29坐果性好，果形為長燈籠形，單果質(zhì)量約為50g,首花節(jié)位低，花期和成熟期早，是一個優(yōu)良的甜椒育種材料(圖1)。據(jù)此，利用PBC688與G29進(jìn)行種間雜交，將抗性基因qCmr2.1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)育，創(chuàng)制新的高抗CMV且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的種質(zhì)材料。本研究利用上述3個InDei分子標(biāo)

33、記對創(chuàng)制的F6代自交系進(jìn)行輔助篩選，結(jié)合人工接種鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查，檢驗抗性基因的轉(zhuǎn)育效率，以期篩選高抗CMV的育種材料。1材料與方法試驗材料母本材料為高抗CMV的C.frutencenscv.PBC68&父本材料為高感CMV的甜椒材料G29。2013年通過父母本種間雜交獲得F1代雜種(圖1)，連續(xù)自交5代，2020年6月獲得109個F6代高代自交系材料。每個自交系選取2株代表1個自交系的遺傳信息，單株留種作為F7代，用于抗CMV效果的人工接種鑒定。1.2試驗方法2020年2-7月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合動物科學(xué)基地對F6代株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查和留種；4-6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實驗室對

34、F6代株系進(jìn)行分子標(biāo)記檢測；8-10月在實驗室用部分F7代株系進(jìn)行抗CMV效果的人工接種鑒定。DNA提取基因組DAN提取使用DNA提取試劑盒(Cat#DP3112，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，按照說明書要求逐步提取DNA。使用1%瓊脂糖凝膠和NanoDropOne(ThermoScientific)檢測DNA的質(zhì)量和質(zhì)量濃度，調(diào)整DNA的質(zhì)量濃度為40ng/yl。InDei分子標(biāo)記輔助篩選抗CMV基因qCmr2.1用于抗CMV基因輔助篩選的3對InDei分子標(biāo)記的引物分別為InDei-2-134-F(5，-TGCTTCAGTTGAGTTGTCCA3)+InDel-2134-R(5-TAA

35、ATCCCCTTGTGGTGGCT-3)、InDei-2-140-F(5-GGTTGGTTAGCATGGGTGTG-3)+InDei-2-140-R(5-CGAAACCGAACCGTTAAAGAC-3)、InDei-2-151-F(5-ACCCACGACTTAAACTCAAAACT-3)+InDel-2-151-R(5-TCAAGAGAGAAATAGTGATGCCA-3)。Keywords：pepper;cucumbermosaicvirus;molecularmarkerassistedselection黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是世界十大植物病毒之一，可

36、以侵染超過100個科的1200種植物1。劉勇等2調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從辣椒中檢出的33種病毒中，CMV的檢出率高達(dá)20.29%，超過煙草花葉病毒的檢出率(14.64%)而成為危害中國辣椒生產(chǎn)的第一大優(yōu)勢病毒。在辣椒生產(chǎn)過程中，CMV不僅影響產(chǎn)量，而且危害果實品質(zhì)，而培育抗性品種是防治CMV最經(jīng)濟、最有效的方法，也是中國辣椒抗病育種的主要目標(biāo)。國內(nèi)外育種家通過抗性轉(zhuǎn)育，已經(jīng)育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品種，但高抗CMV的品種稀缺。由于很多新CMV病毒株系可突破原有抗性，導(dǎo)致現(xiàn)有品種已無法滿足產(chǎn)業(yè)需求。鑒定和轉(zhuǎn)育新的抗CMV基因或?qū)⒍鄠€抗性基因聚合，育成廣譜、持久、高抗CMV的辣椒品種是解決高抗品種稀缺

37、最有效的方法。目前，人們已經(jīng)從辣椒上鑒定出30多個抗CMV相關(guān)的數(shù)量性狀座位(Quantitativetraitlocus，QTL)和基因，除單顯性基因Cmr1外，其他抗性基因均未得到轉(zhuǎn)育應(yīng)用5。傳統(tǒng)育種技術(shù)通過雜交和回交進(jìn)行抗性基因轉(zhuǎn)育，通過田間鑒定或人工接種鑒定進(jìn)行抗性單株的篩選，耗時長、效率低?，F(xiàn)代育種技術(shù)可以通過分子標(biāo)記輔助選擇(Markerassistedselection，MAS)技術(shù)實現(xiàn)抗性基因的快速積累6-7。近年來，高通量基因分型結(jié)合新一代測序技術(shù)可快速檢測與抗病基因緊密連鎖的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，大大縮短了高密度圖譜構(gòu)建、QTL位點分析和候選基因鑒定所需的時間8-10。隨著分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的完善和標(biāo)記類型的增多，越來越多的基因得到定位和克隆，例如MAS技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。Barka等11對辣椒上真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等引起的相關(guān)病害的抗性基因連鎖標(biāo)記開發(fā)和抗性基因克隆進(jìn)行了總結(jié)分析。李寧等12根據(jù)已有文獻(xiàn)公布的抗病分子標(biāo)記對209份辣椒資源進(jìn)行了抗病基因檢測，明確了供試種質(zhì)的抗性基因。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所利用種間雜交、回交和分子標(biāo)記輔助篩選技術(shù)創(chuàng)制出辣椒抗番茄斑