乏氧對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞HIF1α表達(dá)影響的研究

1、乏氧對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞HIF1表達(dá)影響的研究 作者：王霞 王培源 孫善珍 吳淑華 曲迅 張祥盛 【摘要】 目的 初步研究乏氧對(duì)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞HIF1表達(dá)水平的影響。方法 將處于對(duì)數(shù)生長期的Tca8113細(xì)胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合氣體的乏氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在乏氧培養(yǎng)1/2、1、3、6、12和24 h時(shí)取出。每個(gè)時(shí)間段均設(shè)常氧培養(yǎng)對(duì)照組（5%CO2、95%O2）。采用RTPCR技術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞HIF1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 HIF1的表達(dá)在乏氧12 h明顯升高并達(dá)最高峰，24 h時(shí)又下降至常氧水平。每個(gè)時(shí)間段乏氧組HIF1的表達(dá)均高于其相應(yīng)的

2、常氧對(duì)照組。結(jié)論 乏氧影響了人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞HIF1基因的表達(dá)水平，腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)HIF1基因的表達(dá)適應(yīng)腫瘤乏氧的微環(huán)境，有利于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。 【關(guān)鍵詞】 乏氧；缺氧誘導(dǎo)因子1；Tca8113 【Abstract】 Objective To investigate the effect of hypoxia on HIF1 expression in tongue squamous cancer cell line Tca8113 cells.Methods Tca8113 cells in logarithmic grow phase were cultured in hyp

3、oxia(1%O2、5%CO2、94%N2) conditions for 1/2 h，1 h，3 h，6 h，12 h and 24 h,respectively. Expression of HIF1 mRNA were assessed by RT-PCR technique.Results The expression of HIF1 mRNA increased significantly and reached the peack after 12 h of hypoxia,and then decreased to the level of normoxic conditions

4、 at 24 h. The expression of HIF1 mRNA in hypoxia was higher than that in normoxic control groups.Conclusion Hypoxia upregulates the expression of HIF1 mRNA,which makes cancer cells to adopt hypoxia in solid tumor,and to promote tumor development. 【Key words】 hypoxia,HIF1,Tca8113 乏氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，同

5、時(shí)也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的始動(dòng)因素。乏氧條件下腫瘤細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)性變化，導(dǎo)致一系列病理生理過程，其中乏氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor 1,HIF1)在其過程中起著重要作用。HIF1是由HIF1、HIF1兩個(gè)亞單位組成的異二聚體，其中HIF1對(duì)氧的依賴性較強(qiáng)，在調(diào)節(jié)微環(huán)境的氧平衡中起重要作用。已有研究表明HIF1在肺癌、腦腫瘤、乳腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)，并調(diào)節(jié)其生物學(xué)行為，但HIF1在舌癌中的研究鮮見報(bào)道。本研究采用RTPCR技術(shù)半定量檢測(cè)人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞在乏氧培養(yǎng)條件下HIF1mRNA水平的表達(dá)變化，觀測(cè)乏氧對(duì)該基因的影響，為腫瘤的治療尋找新的治療

6、靶點(diǎn)。 1 材料與方法 1.1 主要試劑、儀器與細(xì)胞 RPMI 1640(GIBCO)；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Tca8113人舌鱗癌細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞庫）；乏氧培養(yǎng)箱(HERA cell 150,GERMAN) ；RNA提取試劑盒（Trizol，上海生工）；RTPCR試劑盒（Takara產(chǎn)品）；DL2000 DNA Marker（Takara產(chǎn)品）；PCR儀(Eppendorf，德國)。 1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113單層貼壁生長，細(xì)胞培養(yǎng)液由RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/ ml 青霉素和100 U/ ml 的鏈霉素構(gòu)成。置于5%CO

7、2的37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，更換培養(yǎng)液為無血清培養(yǎng)基，而后進(jìn)行乏氧培養(yǎng)，即把細(xì)胞置于1%O2、5%CO2、94%N2混合氣體的乏氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在乏氧培養(yǎng)1/2、1、3、6、12和24 h時(shí)取出。每個(gè)時(shí)間段均設(shè)常氧培養(yǎng)對(duì)照組（5%CO2、95%O2）。 1.3 細(xì)胞總RNA的抽提（Trizol試劑盒） 將在不同含氧狀態(tài)下培養(yǎng)的細(xì)胞，去除培養(yǎng)液后加PBS溫柔洗滌3次，加Trizol 500 l，充分混勻，-20過夜。加入200 l氯仿，劇烈震蕩混勻30 s；12 000 r/min室溫離心15 min；小心轉(zhuǎn)移上清至RNasefree 1.5 ml離心管里，加入等體積的異丙

8、醇，室溫離心；棄上清，加入無水乙醇洗滌兩次，室溫下使酒精完全揮發(fā)；沉淀用30100 l DEPCH2O溶解。測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸收值進(jìn)行RNA的純度和濃度分析。 1.4 RTPCR檢測(cè) 按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明，以總RNA為模板，以O(shè)ligo（dT）為引物合成cDNA第一條鏈，反應(yīng)溫度為45 25 min，99 5 min，5 5 min。HIF1的引物序列：sense：5GTCTCGAGATGCAGCCAGAT3,antisense：5TCACCAGCATCCA GAAGTTTC3，片段長度為169 bp（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）。在同一試管中加入5PCR Buf

9、fer 10 l，Takara Ex TaqTM HS 0.25 l，Primer 各0.5 l，滅菌三蒸水加至50 l，PCR擴(kuò)增條件為94 20 s，58 20 s，72 1 min，共34個(gè)循環(huán)，最后延伸72 7 min。實(shí)驗(yàn)中以雙蒸水代替cDNA作陰性對(duì)照。 1.5 1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物 取RTPCR產(chǎn)物6 l和Takara DL2000 DNA Marker 5 l電泳，紫外照相。捷達(dá)專業(yè)數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)3.3測(cè)定不同培養(yǎng)條件下HIF1條帶的光密度均值（OD）。 2 結(jié)果 在不同培養(yǎng)條件下除陰性對(duì)照外均顯示169 bp條帶。實(shí)驗(yàn)中常氧對(duì)照組在培養(yǎng)12 h以前基因的

10、表達(dá)呈穩(wěn)定狀態(tài)，12 h以后則呈上升趨勢(shì)；乏氧條件下HIF1隨培養(yǎng)時(shí)間的延長表達(dá)增強(qiáng)，在12 h達(dá)最高峰，24 h時(shí)又下降至常氧水平。每個(gè)時(shí)間段乏氧組HIF1 的表達(dá)均高于其相應(yīng)的常氧對(duì)照組（圖1，2）。 3 討論 近來研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)體積大于1 mm3的實(shí)質(zhì)性腫瘤都有相當(dāng)數(shù)量乏氧的瘤細(xì)胞，且腫瘤內(nèi)乏氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的重要因素，因此對(duì)乏氧的適應(yīng)是腫瘤形成和發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟3。舌癌是口腔癌中發(fā)病率高且易侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的惡性腫瘤之一，腫瘤內(nèi)部同樣存在著乏氧微環(huán)境，影響舌癌的生長、侵襲及其對(duì)放化療的敏感性。 乏氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor1,HI

11、F1）是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)乏氧而產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，由HIF1和HIF1兩個(gè)亞單位組成的異二聚體,其中HIF1對(duì)氧的依賴性較強(qiáng),在調(diào)節(jié)機(jī)體微環(huán)境氧的平衡中起重要作用。常氧下，HIF1在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量維持在較低水平，易于泛素化（ubiquitination）被蛋白酶水解，當(dāng)細(xì)胞氧濃度降低時(shí)，HIF1的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平則呈指數(shù)增加。HIF1需在核內(nèi)與HIF1結(jié)合成二聚體才能形成有活性的HIF1，并可抵抗蛋白水解。乏氧條件下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)許多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生變化，對(duì)乏氧作出應(yīng)激反應(yīng)，這些基因被稱為乏氧反應(yīng)基因（hypoxia response gene，HRG），HRG中受HIF1調(diào)控的基因則稱為HIF1

12、的靶基因。乏氧條件下HIF1調(diào)控如紅細(xì)胞生成素、VEGF、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等40余種靶基因的表達(dá)，這些基因的蛋白產(chǎn)物涉及血管形成、能量代謝、紅細(xì)胞形成、細(xì)胞增殖和存活、血管重塑等，均有利于腫瘤在乏氧條件下的能量代謝和氧輸送4，5。 本實(shí)驗(yàn)利用乏氧培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113，模擬了實(shí)質(zhì)性腫瘤內(nèi)部的乏氧微環(huán)境，通過RTPCR技術(shù)半定量測(cè)定了不同乏氧時(shí)間段HIF1的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF1的表達(dá)隨乏氧時(shí)間的延長表達(dá)增強(qiáng)，在12 h達(dá)最高峰，24 h時(shí)又下降至常氧水平；且每個(gè)時(shí)間段乏氧組HIF1的表達(dá)均高于其相應(yīng)的常氧對(duì)照組。以前有研究認(rèn)為乏氧時(shí)HIF1主要在蛋白水平上改變明顯，而mRNA水

13、平的變化則不明顯6。本研究則顯示乏氧在基因水平上也影響了HIF1的表達(dá)，使其表達(dá)增強(qiáng)，這可能是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)乏氧微環(huán)境維持其生長和侵襲的重要調(diào)控中心，進(jìn)而通過調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。常氧對(duì)照組12 h以后表達(dá)的升高，可能由于培養(yǎng)液營養(yǎng)的耗損，使瘤細(xì)胞處于相對(duì)乏氧的微環(huán)境，也進(jìn)一步證明了乏氧上調(diào)HIF1的效應(yīng)。缺氧、癌基因或抑癌基因改變會(huì)通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活HIF1基因，使其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)增高，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展，并增強(qiáng)其侵襲及轉(zhuǎn)移能力。因此，阻斷HIF1的表達(dá)進(jìn)而阻止其調(diào)節(jié)下游基因的調(diào)控作用將成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。已有學(xué)者利用HIF1啟動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，驅(qū)動(dòng)自殺基因高

14、效表達(dá)，而有效殺傷癌細(xì)胞，抑制了腫瘤的發(fā)展7。 【參考文獻(xiàn)】 1 Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseaseJ. Nature, 2000, 407: 249257. 2 Giatromanolaki A, Harris AL. Tumor hypoxia:hypoxia signaling pathways and hypoxia inducible factor expression in human cancerJ. Anticancer Res, 2001, 21(6B): 43174324. 3Huan

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