生物技術(shù)制藥第2版-第三章-動物細(xì)胞制藥

1、第三章 動物細(xì)胞工程制藥參考教材1.生物技術(shù)制藥 夏煥章 高等教育出版社2. 生物技術(shù)制藥王鳳山 人民衛(wèi)生出版社3. 生物技術(shù)制藥概論姚文兵 中國醫(yī)藥科技出版社22022/8/3第一節(jié) 概述第二節(jié) 動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)第三節(jié) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基第四節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法第五節(jié) 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得第六節(jié) 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式第七節(jié) 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器第八節(jié) 動物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求第九節(jié) 動物細(xì)胞制藥的前景與展望本章內(nèi)容2022/8/33學(xué)習(xí)要求：掌握：動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本要求、培養(yǎng)基的種類及主要組成；生產(chǎn)用細(xì)胞的要求及獲得方法。熟悉：生產(chǎn)用動物細(xì)胞的種類，

2、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法和操作方式。了解：動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的基本知識，動物細(xì)胞制藥的發(fā)展前景。42022/8/3第一節(jié) 概述一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的歷史二、細(xì)胞工程學(xué)三、動物細(xì)胞制藥發(fā)展歷史2022/8/35動物細(xì)胞工程制藥兩大內(nèi)容：在無菌和人工控制的條件下培養(yǎng)動物細(xì)胞以獲得多肽和蛋白質(zhì)藥物；按照預(yù)定的設(shè)計，根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理，采用遺傳操作技術(shù)定向改造動物細(xì)胞及動物細(xì)胞的遺傳性狀，利用轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗、多肽和蛋白質(zhì)。已成為生物制藥最重要的組成部分之一2022/8/36基因重組細(xì)胞組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)：將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，在體外模擬機(jī)體體內(nèi)的生理條件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存

3、和生長。一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的歷史2022/8/37動物細(xì)胞體外培養(yǎng)歷史上的里程碑1885年 德國Roux生理鹽水培養(yǎng)雞胚神經(jīng)板組織，首次提出“tissue culture”1897年 Loeb從血液和結(jié)締組織中分離細(xì)胞可在血清和血漿中存活 1903年 Jolly觀察到蠑螈細(xì)胞在體外可進(jìn)行分裂1907年 Harrison無菌條件下培養(yǎng)了離體的蛙胚神經(jīng)組織，觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長過程；并在實驗中整理出一套合理的無菌操作技術(shù)，被公認(rèn)為組織培養(yǎng)之父1923年Carrel發(fā)明了卡式瓶培養(yǎng)法，將雞胚的心肌組織持續(xù)培養(yǎng)了34年。2022/8/3820世紀(jì)50年代，各種培養(yǎng)操作技術(shù)、培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基孕育而生。

4、Earle首創(chuàng)單個細(xì)胞克隆培養(yǎng)方法，建立了可無限傳代的C3H小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系。1951年，Gay建立了第一個上皮型細(xì)胞系人宮頸癌Hela細(xì)胞系。1957年，Dulbecco采用胰酶消化處理組織塊，用液體培養(yǎng)的方法獲得了單層細(xì)胞，開創(chuàng)了真正意義上的動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。1962年，Capstick成功大規(guī)模懸浮培養(yǎng)小鼠腎細(xì)胞，標(biāo)志著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的起步。1975年，Kohler和Milstein成功融合小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌特定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。動物細(xì)胞體外培養(yǎng)歷史上的里程碑2022/8/39細(xì)胞工程：以細(xì)胞為單位，按照人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技

5、術(shù)使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或生產(chǎn)新品種的目的，使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某些特定產(chǎn)物的能力，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。 P79 二、細(xì)胞工程學(xué)2022/8/310細(xì)胞工程學(xué)（Cellular engineering）Cellular engineering includes tissue engineering and bioprocess engineering. Tissue engineering involves the use of living cells in the development of biological substitutes for the re

6、storation or replacement of function. Bioprocess engineering use of living cells to manufacture a biochemical product, e.g., through the use of recombinant DNA technology. As biomedical engineering has expanded to include the cellular level, and bioprocess engineering has shifted in interest from mi

7、crobial organisms to include mammalian cells, there are intellectual issues in which an interest is shared by these two formerly separate areas of engineering activity. 2022/8/311細(xì)胞工程學(xué)細(xì)胞工程(cellular engineering)包括生物醫(yī)學(xué)工程（biomedical engineering）及生物工藝工程（bioprocess engineering）生物醫(yī)學(xué)工程由組織工程（tissue engineer

8、ing）發(fā)展而來，指運用活細(xì)胞開發(fā)生物再生物或功能替代物，由器官和組織培養(yǎng)發(fā)展至細(xì)胞乃至亞細(xì)胞培養(yǎng)。生物工藝工程是運用活細(xì)胞制造生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)物，通常是運用重組DNA技術(shù) 。由微生物向哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)移二者交叉于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，形成共性的知識產(chǎn)權(quán)由這兩個領(lǐng)域分享。122022/8/3組織工程：利用生物活性物質(zhì)，通過體外培養(yǎng)或構(gòu)建的方法，再造或者修復(fù)器官及組織的技術(shù)。在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，讓細(xì)胞增殖，從而再造器官。 2022/8/313Vacanti Mouse：人耳鼠2022/8/314三、動物細(xì)胞制藥的發(fā)展歷史1949年，Enders及其同事用哺乳動物原代細(xì)胞生產(chǎn)滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗，開創(chuàng)了先河。1

9、986年用淋巴母細(xì)胞Namalwa生產(chǎn)干擾素批準(zhǔn)用于臨床。此后，Vero細(xì)胞生產(chǎn)狂苗和脊髓灰質(zhì)炎疫苗大量應(yīng)用。1987年，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)OKT3單抗批準(zhǔn)用于臨床。1988年之后一大批用轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)的重組基因產(chǎn)品陸續(xù)批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著動物細(xì)胞制藥新型產(chǎn)業(yè)的形成。如今，動物細(xì)胞工程制藥在生物制藥的研究和應(yīng)用中起關(guān)鍵作用，投放市場及臨床試驗中的重組蛋白有70%來自哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)。2022/8/315細(xì)胞工程制藥成為現(xiàn)代制藥技術(shù)中常用的手段。動物細(xì)胞用于生物制品生產(chǎn)可進(jìn)行翻譯后修飾、正確的切割折疊。蛋白正確折疊、二硫鍵形成、多聚化、蛋白酶加工、磷酸化、充分糖基化（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體）廣泛應(yīng)用于生物制品生

10、產(chǎn)疫苗：乙肝疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙腦疫苗細(xì)胞因子：干擾素、EPO、凝血因子VIII等單克隆抗體及抗體類融合蛋白：OKT3、Herceptin、Avastin、Erbitux，Rituximab、Humira等2022/8/3162022/8/3FDA 批準(zhǔn)的抗體藥物全抗體 37個（至2014.10月）抗體片段 3個ADC 3個（1個已撤市）雙特異抗體 2個Fc融合蛋白 7個鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2000Mylotarg200

11、1Campath2002ZevalinHumira2003XolairBexxar2004AvastinErbitux2006LucentisVectibix2007Soliris2008Cimzia2009StelaraSinponi2010ActemraNumax2011BenlystaYervoyAdcetris2012PerjetaEylea2013KadcylaGazyva2014Cyramza SylvantEntyvioKeytruda第二節(jié) 動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的類型二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝三、動物細(xì)胞的培養(yǎng)特性2022/8/318離體培養(yǎng)細(xì)胞分類 貼壁細(xì)胞

12、懸浮細(xì)胞 兼性貼壁細(xì)胞2022/8/3191. 貼壁細(xì)胞（非淋巴組織細(xì)胞、異倍體細(xì)胞） 生長須有可貼附的支持物表面，依靠自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子在表面上生長。 兩種形態(tài)： 上皮細(xì)胞型細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肺泡上皮等皆呈上皮型形態(tài)。胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。2022/8/320成纖維細(xì)胞型 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如來源于淋巴的細(xì)胞。2. 懸浮細(xì)胞（血液、淋巴細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞）2022/8/3213. 兼性貼壁細(xì)胞（CHO、L9

13、29、BHK）兼具上述兩種生長方式。中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO和小鼠肺纖維瘤L929細(xì)胞：當(dāng)貼附在支持物表面上生長時呈上皮或成纖維細(xì)胞的形態(tài)，而當(dāng)懸浮于培養(yǎng)基中生長時呈圓形。2022/8/322二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝1. 動物細(xì)胞的化學(xué)組成蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、水、無機(jī)鹽。2. 動物細(xì)胞的代謝糖酵解、三羧酸循環(huán)2022/8/323三、動物細(xì)胞的培養(yǎng)特性1. 細(xì)胞的分裂周期長2022/8/3242. 多數(shù)細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象接觸抑制（contact inhibition）：細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。特點：保

14、持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時間，但細(xì)胞密度不再增加。 有：大多數(shù)細(xì)胞 無：少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、癌細(xì)胞2022/8/325動物胚胎或幼齡動物的組織、器官細(xì)胞懸浮液胰蛋白酶1代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代？單個細(xì)胞加培養(yǎng)液3. 正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的2022/8/3264. 動物細(xì)胞具有環(huán)境敏感性動物細(xì)胞與植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞相比培養(yǎng)難度要大一些，其主要原因是動物細(xì)胞只有細(xì)胞膜，而沒有細(xì)胞壁的保護(hù)。動物細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，一切影響細(xì)胞膜變形的因素都會影響動物細(xì)胞存活（滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素）。2022/8/327必需氨基酸 維生素 無機(jī)鹽和微量元素 葡萄

15、糖 細(xì)胞生長因子、貼壁因子等5. 動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求高2022/8/328 動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位： 游離核糖體 與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體 游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白，多為糖蛋白（N-鏈寡糖、O-鏈寡糖）。 6. 動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。2022/8/3292022/8/3302022/8/3317. 胞外分泌，純化方便；翻譯后修飾（糖基化），與天然產(chǎn)品一致。2022/8/332動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件動物細(xì)胞營養(yǎng)要求培養(yǎng)基和其他常用液體潔凈及無菌適宜的培養(yǎng)環(huán)境充足營養(yǎng)第三節(jié) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基2

16、022/8/333動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件（一）防止污染潔凈間器皿和器材水（二）培養(yǎng)條件pH滲透壓培養(yǎng)溫度空氣基本營養(yǎng)物質(zhì)2022/8/334（一） 防止污染 1.潔凈室/ 無菌室：（1）定期打掃無菌室：清潔與消毒；（2）CO2培養(yǎng)箱、搖床滅菌（先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射）。（3）實驗前滅菌：打開紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘（4）實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件2022/8/3352.器材的清洗和消毒玻璃器械洗消，初次使用需酸泡金屬器皿（不能泡酸）舉例：布類、玻璃制品、金屬器械

17、等物品：先121, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；培養(yǎng)液、平衡鹽溶液液體：121, 15 磅, 20 分鐘；玻璃瓶：干熱滅菌170, 4 小時。2022/8/3362022/8/337自動雙重純水蒸餾器 純水儀 注射水制水設(shè)備3.水清洗、配制培養(yǎng)液超純水：電阻值大于18M，去內(nèi)毒素。2022/8/338無毒、無污染體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到：無化學(xué)物質(zhì)污染無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）無對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作對于合成

18、培養(yǎng)基，污染主要來源于配置過程，配制所用的水、器皿應(yīng)十分潔凈，配置后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。2022/8/339（二）培養(yǎng)條件1. pH動物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.27.4，低于6.8或高于7.6會對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時可引起細(xì)胞退變甚至死亡。培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統(tǒng)： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4緩沖系統(tǒng)、 NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)等2022/8/3402. 滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。最理想的滲透壓為290300mOsm/kg為調(diào)整培養(yǎng)液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOs

19、m/kg在細(xì)胞培養(yǎng)操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BBS），由無機(jī)鹽和葡萄糖組成。2022/8/3413. 溫度動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：370.5昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：27 溫度過高：細(xì)胞退變甚至死亡溫度過低：降低代謝和生長速度，影響產(chǎn)量2022/8/3424. 空氣方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時，保持瓶內(nèi)有足夠的空間，即培養(yǎng)的液體量不超過總體積的30%。采用生物反應(yīng)器需通氣，采用不同比例的O2、CO2和空氣。2022/8/343二、動物細(xì)胞的營養(yǎng)要求特點：碳源不能為無機(jī)物，大多為葡萄糖氮源不能為無機(jī)物，主要為各種氨基酸，Gln多數(shù)情況下需添加520%的小牛血清或胎牛血清三、培養(yǎng)基及其

20、他溶液（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基（二）常用的其他溶液平衡鹽溶液培養(yǎng)基pH調(diào)整溶液細(xì)胞消化液抗生素溶液2022/8/344 血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限。成分復(fù)雜，組分不穩(wěn)定，影響對產(chǎn)物的提取。易發(fā)生支原體污染（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)基1. 天然培養(yǎng)基（制藥工程不采用）2022/8/3452. 合成培養(yǎng)基 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成。 主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定；成本低。 缺點： 缺少某些成分，細(xì)胞不能增殖、貼壁

21、需添加動物血清（BCS/FBS）。已商業(yè)化的培養(yǎng)基：RPMI1640、MEM、DMEM、F12等。2022/8/346添加小牛血清的作用：（1）提供生長因子和激素（2）提供貼附因子和伸展因子（3）提供結(jié)合蛋白（4）提供必需脂肪酸和微量元素2022/8/347 不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長、繁殖的合成培養(yǎng)基，在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分。3. 無血清培養(yǎng)基（SFM）（1）生長因子和激素（2）結(jié)合蛋白（3）貼附因子和伸展因子（4）有利于細(xì)胞生長的因子和元素?zé)o血清培養(yǎng)基加入添加劑2022/8/348無血清培養(yǎng)基優(yōu)點：第一代：20世紀(jì)5070年代，雖

22、不含血清，但含有大量動物或植物蛋白，如BSA或激素等；第二代：20世紀(jì)8090年代，完全不用動物來源蛋白質(zhì)且蛋白含量很低,使重組蛋白純化簡單，目前市售主要為該類；第三代（PFM/CDM）：完全不含有蛋白，沒有任何動物、人類蛋白或多肽，為表達(dá)產(chǎn)品下游提供極大方便。成分明確，來源可控，提高重復(fù)性。減少動物原性污染，如病毒、支原體等。便于目的終末產(chǎn)品純化，減少干擾。避免血清對細(xì)胞的毒性，如抑制因子、毒性因子。目前無血清培養(yǎng)基已進(jìn)入第三代2022/8/349例： RPMI-1640培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 100單位/毫升加注射水/三蒸水至 1000ml，過濾除菌。

23、調(diào)節(jié)pH值至7.2。加血清（終濃度 10）。 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制不能高壓滅菌2022/8/350（二）動物細(xì)胞培養(yǎng)常用的其他溶液平衡鹽溶液（BSS）：由生理鹽水和葡萄糖組成，具有維持細(xì)胞滲透壓、調(diào)控培養(yǎng)液酸堿平衡功能。常用：Hanks、D-Hanks、Eeale。培養(yǎng)基pH調(diào)整液：大部分合成培養(yǎng)液都呈微酸性，培養(yǎng)前需將pH調(diào)整到所需的范圍，3.7%、5.6%、7.4% NaHCO3、HEPES等。2022/8/3512022/8/3523.細(xì)胞消化液：組織塊解離分散或傳代培養(yǎng)時使細(xì)胞脫離貼壁器皿表面。1）胰蛋白酶溶液：濃度為0.125%，0.25%，消化結(jié)束時加入少量血清或含血清培養(yǎng)基終止酶

24、作用。2）EDTA溶液：濃度0.02%，使用完用Hanks液沖洗干凈。4. 抗生素溶液：防止微生物污染，生物制藥用動物細(xì)胞不添加，常用青霉素-鏈霉素，推薦青霉素的工作濃度為100U/ml，鏈霉素的工作濃度為0.1mg/ml。2022/8/353第四節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)基本方法一、細(xì)胞分離二、細(xì)胞計數(shù)三、細(xì)胞傳代四、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇2022/8/3541. 離心分離從含有細(xì)胞的體液（血液、腹水、羊水等）中分離細(xì)胞2. 消化分離從生物體取組織，利用消化液使組織松散成細(xì)胞懸液，最終獲得所需細(xì)胞消化液：1%胰蛋白酶、0.02%EDTA、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA等一、細(xì)胞分離2022/8/355二、細(xì)胞

25、計數(shù)自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)血球計數(shù)板計數(shù)結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計數(shù)法MTT染色計數(shù)法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán))2022/8/356定義：將細(xì)胞從一個培養(yǎng)器皿中消化、分散并接種至另一個培養(yǎng)器皿中的操作。意義：為維持細(xì)胞生長和獲得更多的細(xì)胞量需進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。避免因密度過大、生存空間不足、代謝產(chǎn)物濃度過高等造成細(xì)胞衰老、死亡。懸浮生長細(xì)胞傳代貼壁細(xì)胞傳代三、細(xì)胞傳代2022/8/357貼壁細(xì)胞傳代的注意事項消化前

26、確定細(xì)胞有無污染加入消化液量要適當(dāng)，搖動時能蓋滿單層細(xì)胞即可消化時間不宜過長，室溫靜置2-5min要終止消化，加入有血清的培養(yǎng)基分種/瓶/皿數(shù)量取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，多數(shù)以20-30萬個/ml，每次1傳2或1傳3為宜；已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次二倍體細(xì)胞每次傳代時應(yīng)寫上傳代次數(shù)傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次2022/8/358四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇1. 細(xì)胞的凍存 在-70以下細(xì)胞內(nèi)酶活性均已停止，代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，可以長期保存。目前都采用-196液氮保存。凍存過程需加入保護(hù)劑，二甲亞砜（DMSO）、甘油。逐漸降溫，保持一定降溫速度，以1/min的速度下降為宜（

27、慢凍）。注意事項：凍存細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期且存活率較高；細(xì)胞應(yīng)處于良好的營養(yǎng)狀態(tài)，凍存前一天換液培養(yǎng)；細(xì)胞密度以1-2106個/ml為宜；凍存用培養(yǎng)基應(yīng)與實際使用的一致，DMSO過濾除菌；凍存管要密封好標(biāo)簽要寫上細(xì)胞名稱，編號和凍存日期。2022/8/3592.細(xì)胞的復(fù)蘇（總的要求是快融）注意事項：從液氮中取出后，立即丟入37-40溫水的搪瓷杯中，并快速攪動加速融化（1min內(nèi)）；用乙醇消毒凍存管外表；盡早除去二甲亞砜（ 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上），離心，換新鮮培養(yǎng)液；隔天觀察細(xì)胞生長情況，再換液一次。2022/8/3602022/8/361第五節(jié) 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得一

28、、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲得三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選四、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性五、細(xì)胞庫的建立 2022/8/36263來源和歷史明確建立和培養(yǎng)歷史清楚細(xì)胞一般特性應(yīng)提供宿主細(xì)胞來源的相關(guān)資料和證明性文件說明是否進(jìn)行過遺傳操作引入外源基因序列描述已進(jìn)行過的研究檢定項目例如：細(xì)胞檢定、內(nèi)源和外源因子檢測等的結(jié)果。培養(yǎng)歷史要有詳細(xì)的記錄和說明，用于建檔和備查。傳代過程中所用的人源或動物源性材料，應(yīng)有說明性材料。一、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求1.需闡述宿主細(xì)胞的基本特征,如形態(tài)、培養(yǎng)和生長一般特性、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液要求。2.盡可能提供宿主細(xì)胞的特征如鑒別標(biāo)志，種屬鑒定如：鼠源、人源

29、和其他動物來源的確證資料。從評價的角度主要關(guān)注追溯性，溯源性CFDA重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細(xì)胞質(zhì)量控制技術(shù)評價的一般原則2022/8/363二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲得早期：1. 原代細(xì)胞 直接取自動物組織器官，經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。 特點：剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài)；需要大量動物，費錢費勞力。 常用：雞胚細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。2022/8/3642. 傳代細(xì)胞系 原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞系。 特點：細(xì)胞分裂增殖旺盛，二倍體核型；有接觸抑制和貼壁依賴性；增殖能力

30、有限，無致瘤性。 常用：人胚肺成纖維細(xì)胞（WI-38、MRC-5、2BS）2022/8/3653. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的或從腫瘤組織中建立的。 特點：長期培養(yǎng)，倍增時間短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。2022/8/366細(xì)胞懸液1代細(xì)胞50代細(xì)胞無限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞系細(xì)胞株注意界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細(xì)胞株和細(xì)胞系!遺傳物質(zhì)改變2022/8/3674. 融合細(xì)胞系細(xì)胞融合(cell fusion) 2022/8/368融合方法病毒誘導(dǎo)融合：最常用的是滅

31、活的仙臺病毒（HVJ），為RNA病毒。化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合：高級脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。電融合：細(xì)胞在電場中極化成偶極子，并沿著電力線排列成串，然后用高強(qiáng)度、短時程的電脈沖擊穿細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞融合。2022/8/3695. 重組工程細(xì)胞系采用基因工程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾改造或重組，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細(xì)胞系。2022/8/370（一） 真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：1. 病毒載體 牛痘病毒用構(gòu)建多價疫苗 腺病毒用于基因治療 逆轉(zhuǎn)錄病毒用于基因治療 桿狀病毒用于外源基因表達(dá)三、基因工程

32、細(xì)胞的構(gòu)建和篩選（略）2022/8/371 桿狀病毒作為載體的優(yōu)點：雙鏈DNA，易重組插入78kb DNA不影響正常病毒粒子的形成。多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%30%；2022/8/372用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽性克隆。 如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源基因。光鏡照片掃描電鏡照片2022/8/3732. 質(zhì)粒載體穿梭質(zhì)粒載體：在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增。基本成分： 允許載體在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。 含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。

33、用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。 有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。2022/8/374（二） 基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選2022/8/375基因載體導(dǎo)入動物細(xì)胞的常用方法： 磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加在Na2HPO4溶液內(nèi)，和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。 電穿孔法：借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。2022/8/376四、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性2022/8/377CHO-K1（CHO-DG44

34、、CHO-S）實驗中常用的一個細(xì)胞株，在生物制藥中使用也非常廣泛。來源：Cricetulus griseus (中國倉鼠) 卵巢 形態(tài)：上皮細(xì)胞生長特性：兼性（懸浮、貼別）培養(yǎng)基：DEME培養(yǎng)基，0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷，10%小牛血清，加入脯氨酸。凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮。2022/8/378Vero： 1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。 是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被批準(zhǔn)用于人體。2022/8

35、/379 BHK-21來源：地鼠幼鼠腎臟形態(tài)：成纖維樣細(xì)胞生長特性：貼壁核型：2n=44培養(yǎng)基：DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。2022/8/380Namalwa： 1972年來源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞。 該細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有1214條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用的培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。2022/8/381五、細(xì)胞庫的建立生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫：1. 原始細(xì)胞庫/主細(xì)胞庫

36、（PBC，master cell bank，MBC）2. 生產(chǎn)用細(xì)胞庫（manufacturers working cell bank，MWCB）或工作細(xì)胞庫（working cell bank，WCB）細(xì)胞庫要求：穩(wěn)定，均一和同質(zhì)，充分全面的檢定，保存的數(shù)目及傳代水平保證生產(chǎn)用細(xì)胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)。2022/8/382種子庫的建立、檢定、保存及傳代穩(wěn)定性資料 （ICH Q5B,Q5D 中國藥典（三部）“通則”）建立兩級細(xì)胞（種子）庫，要求來源、詳細(xì)的傳代歷史、制備方法，包括建庫過程的培養(yǎng)方法、試劑、代次、貯存條件。保證連續(xù)生產(chǎn)的建庫策略（方案），包括生產(chǎn)時細(xì)胞庫的使用率、新工作種子庫的建立頻次

37、（周期）、種子庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 以確保均一、可追溯主細(xì)胞（種子）庫（Master Cell Bank） 從最初克隆或源于最初克隆的初級細(xì)胞庫獲得貯存時須有該細(xì)胞的詳細(xì)檔案，包括：該細(xì)胞系的歷史該細(xì)胞系的特性對各種有害因子的檢查結(jié)果工作細(xì)胞（種子）庫 來源于一支或多支 MCB，新制備的 WCB 應(yīng)檢定并符合生產(chǎn)要求。2022/8/383 種子庫的檢定及穩(wěn)定性（Derivation and Characterisation of Cell Substrates） 目的：證實用于生產(chǎn)的種子特征、生物純度以保證可用性（質(zhì)量） 鑒別：有限的種屬鑒別：選擇性培養(yǎng)基，輔以噬菌體分型法（phage typing

38、）表達(dá)質(zhì)粒相關(guān)鑒別：DNA水平及產(chǎn)物水平 純度：無外源性微生物因子及細(xì)胞污染，如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒因子等。 穩(wěn)定性：產(chǎn)物表達(dá)的一致性（consistent）及在規(guī)定貯存條件下產(chǎn)能的維持。至少兩個時間點的測試：最少傳代培養(yǎng)細(xì)胞及生產(chǎn)申請時使用達(dá)到細(xì)胞體外傳代限度或超過該限度的細(xì)胞，以確定傳代的次數(shù)。2022/8/384兩級細(xì)胞庫及細(xì)胞庫大小的確立依據(jù)2022/8/385第六節(jié) 動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)（2）多孔載體培養(yǎng)（3）微囊化培養(yǎng)2022/8/3861. 懸浮培養(yǎng)（suspension culture）：細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。適用于非貼

39、壁依賴性細(xì)胞和兼性細(xì)胞。優(yōu)點：操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和 傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，經(jīng)驗豐富目前生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌式生物反應(yīng)器。2022/8/387細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。適用于貼附依賴性細(xì)胞和兼性細(xì)胞。2. 貼壁培養(yǎng)（anchorage-dependent culture）2022/8/388優(yōu)點：適用細(xì)胞種類廣，易采用灌流培養(yǎng)使細(xì)胞達(dá)到高密度缺點：操作比較麻煩，需要貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差；傳代時需要用酶消化。目前生產(chǎn)中用于貼壁培養(yǎng)的設(shè)備主要是轉(zhuǎn)床反應(yīng)器。2022/8/3893. 貼壁-懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)（2

40、）多孔載體培養(yǎng)（3）微囊化培養(yǎng)（4）中空纖維培養(yǎng)法2022/8/390（1）微載體培養(yǎng)（microcarrier culture） 使依賴貼壁的細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)時貼附在顆粒表面單層生長，增加細(xì)胞貼附生長的面積。在載體上培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生抗原、干擾素、疫苗等的能力與常規(guī)單層貼壁培養(yǎng)細(xì)胞相當(dāng)。2022/8/391優(yōu)點：兼有懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)的優(yōu)點，適用于正常細(xì)胞核二倍體傳代細(xì)胞。創(chuàng)造大的貼附面積、攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。MCC細(xì)胞在Cytodex-3微載體表面貼附生長情況 理想的微載體應(yīng)具備P59： 生物相容性；無毒性；表面惰性；比重適當(dāng)；粒徑均一，在60250m之間；光學(xué)透明；載體基質(zhì)柔軟；耐

41、高壓、高溫；反復(fù)多次使用；制備簡單，原料充分。2022/8/392（2）多孔微載體近年發(fā)展起來大規(guī)模、高密度動物細(xì)胞培養(yǎng)方法。內(nèi)部多孔，提供細(xì)胞生長，避免受攪拌等造成機(jī)械損傷；攪拌速度和通氣量可提高，細(xì)胞營養(yǎng)、氧氣傳質(zhì)速度增加；2022/8/393（3）包埋和微囊培養(yǎng)借鑒了酶固定化技術(shù)，模擬人工細(xì)胞，將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。優(yōu)點：細(xì)胞獲得保護(hù)，減少剪切力損傷；較高細(xì)胞密度終產(chǎn)品濃度和純度都得以提高。2022/8/394（4）中空纖維反應(yīng)器由外殼和數(shù)以千計的醋酸纖維制成的中空纖維(內(nèi)徑200m -500m，外徑300m -900m)組成。內(nèi)層緊密、光滑，具有一定分子量截流值。 外層為

42、多孔的海綿狀支持層，細(xì)胞被固定在支持層中 。反應(yīng)器的形狀為管式或列管式，中空纖維可承受較大壓力，通過正常超濾程序?qū)⒌孜飰喝雰?nèi)壁與海綿狀介質(zhì)上的酶起反應(yīng)。 一、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及基本結(jié)構(gòu)二、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng)三、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的主要操作模式962022/8/3第七節(jié) 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器第七節(jié) 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器理想的動物生物反應(yīng)器的基本要求：各種材料對細(xì)胞必須無毒性；良好的傳質(zhì)、傳熱和混合性能；密封性能良好，可避免外來微生物的污染；對物化參數(shù)可自動檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一；可長期連續(xù)運轉(zhuǎn)；容器加工制造時要求內(nèi)面光滑，無死角；拆裝、連接和清潔

43、方便，耐高壓蒸汽消毒便于操作維修；設(shè)備成本盡可能低。2022/8/3971. 攪拌式生物反應(yīng)器2. 氣升式生物反應(yīng)器3. 中空纖維式生物反應(yīng)器4. 透析袋或膜式生物反應(yīng)器5. 固定床或流化床式生物反應(yīng)器6.一次性生物反應(yīng)器一、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型及其基本結(jié)構(gòu)2022/8/3981. 攪拌式生物反應(yīng)器通用式發(fā)酵罐2022/8/399（1）罐體的高徑比一般采用11.5:1；培養(yǎng)動物的罐底為圓形，以避免細(xì)胞和載體沉積在周邊；（2）攪拌速度慢，一般在20100r/min，多數(shù)采用較大的傾斜式槳葉攪拌器或船舶推進(jìn)式槳葉攪拌器；（3）一般采用無氣泡通氣系統(tǒng)，以解決由于氣泡破裂時產(chǎn)生的應(yīng)力對細(xì)胞的損傷；

44、改造：2022/8/3100籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器： 通氣/調(diào) pH 都在籠內(nèi)進(jìn)行，產(chǎn)生的氣泡由 400 目的不銹鋼絲網(wǎng)阻斷，不會因氣泡破裂產(chǎn)生剪切力直接損傷細(xì)胞，氣孔由多孔分布器發(fā)散，以滿足細(xì)胞對溶氧的需求。2022/8/31012. 氣升式生物反應(yīng)器特點：與攪拌式生物反應(yīng)器相比，剪切力小，反應(yīng)器徑高比一般為10 :1，氣泡直徑12mm，空氣流速 0.010.06 vvm；主要用于微載體培養(yǎng)。2022/8/31023. 中空纖維式生物反應(yīng)器纖維材料為聚砜或丙烯共聚物，纖維壁厚為50100m，呈多孔性，內(nèi)層為超濾膜，內(nèi)腔直徑為200 m。由數(shù)百乃至數(shù)千根中空纖維集束組成的反應(yīng)器，可以垂直也可為

45、平行床式，主要用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)2022/8/3103將反應(yīng)器內(nèi)設(shè)置成二室或三室系統(tǒng)，根據(jù)需要室間裝有濾膜?？蓪⒂泻Υx產(chǎn)物透析或過濾掉，從而使細(xì)胞生長至更高密度，同時可根據(jù)需要選用不同相對分子質(zhì)量的膜，使產(chǎn)物保留在膜內(nèi)或與細(xì)胞分離開。4. 透析袋或膜式生物反應(yīng)器2022/8/31042022/8/31055. 固定床或流化床式生物反應(yīng)器裝填的材料可以是一切對細(xì)胞無毒、又有利于細(xì)胞貼附的材料，有實心載體和有孔載體兩類。多適合微載體、灌流培養(yǎng)。2022/8/3106Celligen plus生物反應(yīng)器NBS公司在原來的籠式通氣攪拌式基礎(chǔ)上，開發(fā)Celligen plus生物反應(yīng)器，其是將通氣攪拌與

46、固定床巧妙結(jié)合的一種新型生物反應(yīng)器2022/8/31076. 一次性生物反應(yīng)器1082022/8/3一次性生物反應(yīng)器特點袋子一次性使用，可消除污染及交叉污染。降低大量清洗成本減少GMP的驗證工作。1092022/8/3 一次性搖袋式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器（Wave）：研發(fā)始于1996年，1998年投入商品化生產(chǎn)，適用于各種類型細(xì)胞培養(yǎng)：CHO，NS0，BHK, HEK293，T細(xì)胞、雜交瘤等。培養(yǎng)基液體在袋中形成波浪式運動，良好的混合作用，剪切力??；一次性搖動細(xì)胞生物反應(yīng)器1102022/8/3由實驗室搖床培養(yǎng)模式線性放大，適合各種動物細(xì)胞及植物細(xì)胞培養(yǎng)；更低剪切力、更高傳質(zhì)效率；目前市售最大20

47、0L，正在開發(fā)2500L規(guī)模。微型一次性攪拌細(xì)胞生物反應(yīng)器1112022/8/3+攪拌式微型生物反應(yīng)器，由大規(guī)模攪拌式生物反應(yīng)器線性縮小，工作體積1015ml；適合懸浮細(xì)胞培養(yǎng)；便于多參數(shù)優(yōu)化及線性放大；可同時進(jìn)行48個獨立反應(yīng)器工作。二、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng)1. 培養(yǎng)過程需檢測的物化參數(shù) 直接在線檢出：溫度、pH、攪拌速度、溶氧 取樣離線檢測：活細(xì)胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖、乳酸和銨離子的檢測 檢測后計算：細(xì)胞的群體倍增時間、細(xì)胞的比增長率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應(yīng)器生產(chǎn)率2022/8/31122. 主要參數(shù)的檢測和控制方法（1）溫度（2）pH在培養(yǎng)初期，控制進(jìn)CO2量

48、 當(dāng)細(xì)胞密度提高后控制NaHCO3的量 （3）溶氧 （4）攪拌 （5）進(jìn)出液流量 （6）其它 動物細(xì)胞對攪拌引起的剪切力和氣泡很敏感，要保持所需的溶氧很困難，常采用的措施有：改變進(jìn)氣的組成：不同比例的O2、N2、CO2和空氣加大通氣流量適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速在反應(yīng)器外通氣適當(dāng)提高罐壓2022/8/3113三、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式分批式培養(yǎng)（batch）/補(bǔ)料-分批式（fed-batch）半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous）灌流式培養(yǎng)（perfusion）2022/8/31141.分批式/流加-分批式分批式（Batch）：較早期采用的方式，也是其他操作方式的基礎(chǔ)。將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后一次性加入反應(yīng)

49、器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程體積不變，不添加其他成分，而只向培養(yǎng)基中通入氧，能夠控制pH、溫度、通氣量。一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基。流加-分批式（Fed-batch）：在batch培養(yǎng)基礎(chǔ)上，細(xì)胞初始接種培養(yǎng)基體積一般為1/22/3，過程中流加濃縮營養(yǎng)成分，保持濃度不變，結(jié)束后將反應(yīng)物取出。2022/8/31152.半連續(xù)式操作定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養(yǎng)物連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。2022/8/31163.灌流式操作（Perfusion，continuous）定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一

50、起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。與半連續(xù)式操作不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出了部分細(xì)胞。優(yōu)點：細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低；可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間縮短，可及時收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高；2022/8/31171182022/8/31192022/8/3一、動物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法二、動物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求第八節(jié) 動物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求（略）2022/8/3120下游純化成分復(fù)雜：工程細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，常和宿主蛋白、培養(yǎng)基成分，特別當(dāng)采用有血清培養(yǎng)基時小牛血清中的各種蛋白成分都將與產(chǎn)物混雜在一起，分離難度大。人用藥物純度要求高：為防雜質(zhì)對人體的有害作用，對產(chǎn)品的純度