分子生物學(xué)染色體與DNA下課件

1、第二章 染色體與DNA 生物基因在染色體上的排列一般是穩(wěn)定的，它們的遺傳方式也是遵從孟德爾方式的。但是在上個世紀(jì)40年代末，Barbara McClintock發(fā)現(xiàn)了遺傳因子的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，她是在對玉米籽粒顏色變化的研究中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象的，并在1951年發(fā)表了她的研究結(jié)果，對轉(zhuǎn)位因子作了精確的描述。 可移位遺傳因子的發(fā)現(xiàn)六、DNA的轉(zhuǎn)座第1頁，共93頁?？梢莆贿z傳因子的發(fā)現(xiàn) 在美國，人們見到的玉米籽粒大多是黃色的，但是在玉米的發(fā)源地中、南美洲，野生型的玉米籽粒卻可以是藍(lán)色、棕色和紅色的。玉米粒的顏色取決于籽粒胚乳表層的色素，而這種色素的合成是受基因調(diào)控的。人們可以見到在同一個玉米棒子上存在著幾種顏色

2、的玉米粒，這種現(xiàn)象稱為“斑駁”。第2頁，共93頁?？梢莆贿z傳因子的發(fā)現(xiàn) 20世紀(jì)30-40年代從事玉米遺傳研究的McClintock遇到的斑駁現(xiàn)象，用傳統(tǒng)的孟德爾定律解釋不了。當(dāng)按照孟德爾定律應(yīng)是全部黑色籽粒玉米的時候，卻出現(xiàn)了全黑:花斑:白色為12:3:1的分布。她在大量實(shí)驗(yàn)和分析的基礎(chǔ)上提出了一個假說，認(rèn)為這些斑駁變異是特殊基因成分活動的結(jié)果。原來，決定胚乳色素和其他特性的基因位于9號染色體。她發(fā)現(xiàn)，9號染色體上有一小段從一個位置移到另一個位置時，就會出現(xiàn)斑駁現(xiàn)象，她將具有改變鄰近基因功能的遺傳材料稱作“控制因子”。 第3頁，共93頁。可移位遺傳因子的發(fā)現(xiàn) 1950年她進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)玉米染色體

3、組中存在著一個激活解離系統(tǒng)。該系統(tǒng)由激活因子（Activator, Ac）和解離因子（Dissociation, Ds）構(gòu)成。它們在染色體上的位置不定，可以從一條染色體跳到另一條染色體上。Ds的功能是抑制鄰近基因的表達(dá)，同時由于它的跳躍（即轉(zhuǎn)座）而引起原來染色體的斷裂和缺失。而Ac可以激活Ds。這種能跳躍的遺傳成分就是“轉(zhuǎn)座基因”，現(xiàn)在稱它們?yōu)椤稗D(zhuǎn)座子”。 第4頁，共93頁?？梢莆贿z傳因子的發(fā)現(xiàn) 當(dāng)時她的工作并未引起人們的重視，直到20世紀(jì)60年代后期在大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子，這才引起了對McClintock工作的重視，并開展了廣泛深入的研究。McClintock因其開創(chuàng)性的工作而獲得了19

4、83年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。 現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這類可移位的遺傳因子普遍存在于各種生物中，它們可以較頻繁地在染色體DNA上轉(zhuǎn)移位置，所以也稱它們?yōu)樘S基因。它們位置的轉(zhuǎn)移，會影響別的基因表達(dá)，造成表型上的改變。 第5頁，共93頁。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1983for her discovery of mobile genetic elementsCold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, NY, USABarbara McClintockb. 1902 d. 1992第6頁，共93頁。

5、轉(zhuǎn)座子 典型的轉(zhuǎn)座子（transposon）是一段可移位的DNA片段，兩端有反向重復(fù)序列，中間有1個或幾個基因。玉米中的AcDs就是McClintock發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座子的移位過程稱為轉(zhuǎn)座（transposition）。 轉(zhuǎn)座子的大小通常為幾百到幾千堿基對，大部分基因組含有幾種轉(zhuǎn)座子，每種轉(zhuǎn)座子又有幾個到幾百個拷貝，所以轉(zhuǎn)座子也是基因組中的一種散布重復(fù)序列。 第7頁，共93頁。典型轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)模式圖第8頁，共93頁。轉(zhuǎn)座的兩種方式 轉(zhuǎn)座子可以被一些未知的信號激活，在染色體上從一個位點(diǎn)跳到另一個位點(diǎn)。轉(zhuǎn)座作用需經(jīng)轉(zhuǎn)座酶催化，有些轉(zhuǎn)座子的編碼區(qū)就編碼有轉(zhuǎn)座酶。當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因受某種信號激活表達(dá)后，產(chǎn)生

6、的轉(zhuǎn)座酶能識別轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復(fù)序列。轉(zhuǎn)座方式有兩種，一種是保守型轉(zhuǎn)座（直接轉(zhuǎn)座），它將轉(zhuǎn)座子從原位點(diǎn)切下，再插入到一個新的位點(diǎn)，在插入位點(diǎn)處產(chǎn)生短的同向重復(fù)序列。另一種方式是復(fù)制型轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)座子發(fā)生復(fù)制，復(fù)制的拷貝插入新的位點(diǎn)。 第9頁，共93頁。在轉(zhuǎn)座子插入處產(chǎn)生短的同向重復(fù)序列第10頁，共93頁。直接轉(zhuǎn)座和復(fù)制轉(zhuǎn)座第11頁，共93頁。直接轉(zhuǎn)座和復(fù)制轉(zhuǎn)座第12頁，共93頁。原核生物中的轉(zhuǎn)座子1. 插入序列（insertional sequence, IS） 插入序列是最簡單的轉(zhuǎn)座子，它的兩端是反向重復(fù)序列，中間含有轉(zhuǎn)座酶基因。2. TnA轉(zhuǎn)座子家族（TnA family） TnA轉(zhuǎn)座子家族

7、的轉(zhuǎn)座子除了攜帶轉(zhuǎn)座酶基因外，還帶有抗藥性（或其他）標(biāo)記基因。這些轉(zhuǎn)座子較大，包括Tn1, Tn3, Tn 501等。3. 復(fù)合轉(zhuǎn)座子（composite transposon） 這類轉(zhuǎn)座子兩端是插入序列（IS），中間帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）。復(fù)合轉(zhuǎn)座子中有些IS失去了功能，只能作為復(fù)合轉(zhuǎn)座子的一部分一起轉(zhuǎn)座。有些IS還保有功能，它們也能單獨(dú)轉(zhuǎn)座。第13頁，共93頁。某些細(xì)菌轉(zhuǎn)座子（IS）的特征插入位點(diǎn)處產(chǎn)生的正向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座子兩端的反向重復(fù)序列第14頁，共93頁。TnA轉(zhuǎn)座子家族的結(jié)構(gòu)第15頁，共93頁。含有同向IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子第16頁，共93頁。含有反向IS的復(fù)合轉(zhuǎn)座子第17頁

8、，共93頁。自主轉(zhuǎn)座子與非自主轉(zhuǎn)座子 編碼有轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座子是自主的，它們能夠啟動自身的轉(zhuǎn)座。還有一些轉(zhuǎn)座子不含轉(zhuǎn)座酶基因(或含有缺失部分序列的轉(zhuǎn)座酶基因)，它們是不自主的，必須在有相應(yīng)自主轉(zhuǎn)座子存在下，依靠自主轉(zhuǎn)座子表達(dá)出的轉(zhuǎn)座酶而轉(zhuǎn)座。 第18頁，共93頁。自主轉(zhuǎn)座子與非自主轉(zhuǎn)座子第19頁，共93頁。真核生物中的轉(zhuǎn)座子1. 玉米中的控制因子（1）Ac-Ds系統(tǒng)（activator- dissociation system） 在玉米Ac-Ds家族中，Ac是自主轉(zhuǎn)座子（活化因子），Ds是非自主轉(zhuǎn)座子（解離因子）。Ac因子長4563bp，兩端各有一個11bp長的反向重復(fù)序列，從約300bp處開始至

9、約4300bp處為轉(zhuǎn)錄區(qū)域，其中有5個外顯子和4個內(nèi)含子，形成一個長約3.5kb的mRNA，該mRNA翻譯出一個807個氨基酸的轉(zhuǎn)座酶。該家族的成員通過非復(fù)制型機(jī)制轉(zhuǎn)座。第20頁，共93頁。玉米轉(zhuǎn)座子 Ac 以及衍生的幾種 Ds 結(jié)構(gòu)第21頁，共93頁。Ds 因子的類型 按Ds內(nèi)部序列的結(jié)構(gòu)和功能不同，將它們分為型和型。當(dāng)型Ds因子插入某個基因時，通常會引起染色體斷裂，回復(fù)突變率低；而型Ds因子幾乎不引起染色體斷裂，回復(fù)突變率高。在結(jié)構(gòu)上型Ds因子是Ac因子的簡單缺失，型Ds因子卻是兩個相鄰或是一個Ds反向插入另一個Ds中形成雙Ds因子。第22頁，共93頁。Ac和Ds因子兩端序列的作用 Ac和

10、Ds因子兩端的序列是轉(zhuǎn)座酶的識別位點(diǎn)，兩端反向重復(fù)序列的存在可以使轉(zhuǎn)座子形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，若插入基因中的轉(zhuǎn)座子的末端序列發(fā)生了變化，它就不能再割離了，使突變成為永久性的。 將Ac因子引入煙草、馬鈴薯、番茄、胡蘿卜、擬南芥、矮牽牛中，Ac因子能正常轉(zhuǎn)座。第23頁，共93頁。尋找轉(zhuǎn)座子的方法 由于對轉(zhuǎn)座子編碼蛋白了解很少，并且這些蛋白的含量也很低，難以檢測和純化，所以一般不用分離其mRNA再做成cDNA克隆、制備cDNA探針的方法來尋找轉(zhuǎn)座子，而是找出帶有轉(zhuǎn)座子的突變基因，再從中找出轉(zhuǎn)座子的方法來尋找轉(zhuǎn)座子。 第24頁，共93頁。1. 玉米中的控制因子（2）Spm-dSpm系統(tǒng)（Suppressor-

11、promoter- Mutator system） Spm家族由自主的Spm因子和大量的非自主的dSpm因子組成。Spm長8.3kb，兩端為13bp的反向重復(fù)序列，中間編碼一個5.8kb的前體mRNA，通過對前體mRNA的不同加工，產(chǎn)生2500bp（tnpA）和6000bp（tnpB）兩種不同的mRNA，合成出兩種不同的蛋白，即67kD的TNPA和132kD的TNPB，TNPA的表達(dá)量比TNPB高100倍。Spm的插入在插入位點(diǎn)產(chǎn)生3bp的正向重復(fù)序列。dSpm是Spm缺失所成，因Spm-w只缺失了內(nèi)含子部分，所以它有弱的自主性。第25頁，共93頁。玉米轉(zhuǎn)座子Spm以及幾個非自主衍生物的結(jié)構(gòu)第

12、26頁，共93頁。2. 果蠅中的轉(zhuǎn)座子（1）Copia轉(zhuǎn)座子 果蠅的Copia轉(zhuǎn)座子是一種逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。它們在轉(zhuǎn)座時必須有逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生，它們的轉(zhuǎn)座過程稱為逆轉(zhuǎn)座作用（retroposition）。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又分為病毒類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）和非病毒類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）兩類，前者的兩端有長的同向重復(fù)（Long terminal repeats, LTR）序列，后者常含有3末端poly（A）序列。第27頁，共93頁。果蠅Copia轉(zhuǎn)座子和酵母Ty轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu) Copia因子長約5kb，末端帶有276bp的正向重復(fù)。正向重復(fù)序列本身的兩端又存在反向重復(fù)。在插入位點(diǎn)產(chǎn)生一

13、個5bp的正向重復(fù)序列。第28頁，共93頁。果蠅的P因子 果蠅中有一種轉(zhuǎn)座子叫P因子。P因子的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中有三個內(nèi)含子。在含有P因子的體細(xì)胞中，它的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只能剪接除去第1和第2個內(nèi)含子，翻譯產(chǎn)物為66KD的轉(zhuǎn)座阻遏物。這是因?yàn)樵隗w細(xì)胞中，有一個蛋白結(jié)合到第3個內(nèi)含子處阻礙了第3個內(nèi)含子的剪接。在含有P因子的卵細(xì)胞或受精卵細(xì)胞中，缺少這個阻礙剪接的蛋白，所以第3個內(nèi)含子能被剪接，翻譯產(chǎn)物為87KD的轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶能使P因子高頻率地轉(zhuǎn)座，但轉(zhuǎn)座阻遏物的存在能抑制轉(zhuǎn)座酶的作用。第29頁，共93頁。第30頁，共93頁。P因子轉(zhuǎn)座導(dǎo)致雜交后代不育 含有P因子的果蠅的細(xì)胞型為P型（paternal

14、 contribution，父本貢獻(xiàn)型），不含P因子的果蠅的細(xì)胞型為M型（maternal contribution，母本貢獻(xiàn)型）。 P型雄蠅與M型雌蠅雜交，產(chǎn)生的后代是不育的。而P型雄蠅P型雌蠅、M型雄蠅P型雌蠅、M型雄蠅M型雌蠅，后代都是可育的。 這是因?yàn)镸型雌蠅不含P因子，卵細(xì)胞中也就沒有P因子的轉(zhuǎn)座阻遏物，當(dāng)被帶有P因子的精子授精后，P因子在受精卵細(xì)胞中產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶，高頻率轉(zhuǎn)座的結(jié)果破壞了許多基因，導(dǎo)致后代不育。第31頁，共93頁。第32頁，共93頁。P因子轉(zhuǎn)座導(dǎo)致雜交后代不育 在M型雄蠅M型雌蠅中，因父母本都無P因子，所以后代是可育的。 在P型雄蠅P型雌蠅、M型雄蠅P型雌蠅中，因卵細(xì)胞

15、質(zhì)中含有轉(zhuǎn)座阻遏物（在它們還沒有成為卵細(xì)胞之前產(chǎn)生的），能阻止轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座作用，不管轉(zhuǎn)座酶是來自父本的P因子還是來自母本的P因子。所以后代都是可育的。 這種因母本細(xì)胞質(zhì)的因素而決定遺傳性狀的主要原因是：在受精卵中，細(xì)胞質(zhì)是由卵細(xì)胞提供的。 第33頁，共93頁。書上P60倒1行P61第一行： 實(shí)驗(yàn)證明，果蠅中幾乎所有的雜種不育都是由于P轉(zhuǎn)座子插入基因組W位點(diǎn)而引起的。（這句話是錯的，原文如下） The nature of the P-specific sequences was first identified by mapping the DNA of w mutants found amon

16、g the dysgenic hybrids. All the mutations result from the insertion of DNA into the w locus. (The insertion inactivates the gene, causing the white-eye phenotype for which the locus is named.) The inserted sequence is called the P element.第34頁，共93頁。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與逆轉(zhuǎn)錄病毒很相似。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄病毒都是可移動的遺傳因子

17、，兩者都含有促進(jìn)它們在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的信息，都需要逆轉(zhuǎn)錄的過程；病毒不同于轉(zhuǎn)座子主要是在生活周期的某些階段由蛋白質(zhì)包裝成病毒顆粒。為了更好地了解逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，有必要先了解一下逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)和生活史。第35頁，共93頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒具有單鏈正義RNA基因組，大多數(shù)植物病毒也是具有單鏈正義RNA基因組，但逆轉(zhuǎn)錄病毒繁殖時必須經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，而具有單鏈正義RNA基因組的植物病毒的生活史中沒有逆轉(zhuǎn)錄過程。已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒只侵染動物細(xì)胞。 第36頁，共93頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期模式圖 逆轉(zhuǎn)錄病毒由單鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、衣殼蛋白、外膜蛋白組成。艾滋病毒就是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒。 第37頁，共93頁。原病

18、毒 DNA 由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄出的雙鏈DNA稱為原病毒DNA（provirus）。原病毒DNA與單鏈正義RNA有所不同，前者兩端有長末端重復(fù)（long terminal repeats，LTRs，U3-R-U5），而LTR本身兩端有短的反向重復(fù)序列。原病毒DNA能插入到寄主細(xì)胞染色體的幾乎所有位點(diǎn)上，在插入處造成短的正向重復(fù)序列，所以原病毒DNA與轉(zhuǎn)座子很相似。 原病毒DNA插入染色體后，可隨著寄主染色體的復(fù)制而復(fù)制，隨著細(xì)胞的分裂而傳給子代細(xì)胞。 第38頁，共93頁。tRNA引物DNA負(fù)鏈DNA正鏈RNA酶H降解R和U5正鏈RNA基因組第一次跳躍逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程PB：引物結(jié)合位點(diǎn)第39頁，

19、共93頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程第二次跳躍雙鏈原病毒DNA第40頁，共93頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因 在原病毒DNA中間的編碼區(qū)有三個基因：gag基因編碼衣殼蛋白，pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，env基因編碼外膜蛋白。自組裝的病毒可以通過出芽方式分泌出去，再感染其它細(xì)胞，從原病毒DNA上轉(zhuǎn)錄下來的mRNA經(jīng)過加工，有的用來翻譯蛋白質(zhì)，有的用作子代病毒的基因組RNA。 第41頁，共93頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒原病毒DNA的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄表達(dá)過程第42頁，共93頁。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)與逆轉(zhuǎn)錄病毒的原病毒DNA很相似，也以長末端重復(fù)為兩端，一端帶有被寄主細(xì)胞RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄的信號。但逆轉(zhuǎn)

20、錄轉(zhuǎn)座子只編碼與逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶有相當(dāng)同源性的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，沒有編碼衣殼蛋白和外膜蛋白的基因，所以LTR-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子很可能是缺損的逆轉(zhuǎn)錄病毒。Copia序列含有一個長4227 bp的閱讀框，閱讀框的一部分與反轉(zhuǎn)錄病毒的gag和pol序列同源。值得注意的是閱讀框中沒有與反轉(zhuǎn)錄病毒的env序列同源的部分，表明Copia和Ty一樣不能產(chǎn)生病毒樣顆粒。 第43頁，共93頁。LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)模式NA：核酸結(jié)合蛋白 PR：蛋白酶 RT：逆轉(zhuǎn)錄酶RH：RNase H IN：整合酶transcriptiongagpol NA PR R T RH IN U3 R U5U3 R U5LT

21、RLTR第44頁，共93頁。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR的性質(zhì)類型名稱LTR末端5 3LTR長度/bp左 右靶位點(diǎn)側(cè)向重復(fù)序列copia型Ta1Tnt1Tst1TG CATG CATG CA514 514610 610285 283ATCAA,CTTTC, TTTAT GAAGTTAGTCgypsy型Del1IfgTG CATG CA2406 2415331 333ATTTT, TATATAAGTA, ATATA /C未確定類型Cin1Bs1Wis-2Pdr1TG CATG CATG CATG CA691（單LTR）302 302？ ？156 156CTCG, ATAAT, GTTAGGCCACGGTA

22、CATACC第45頁，共93頁。無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端不具有同向或反向重復(fù)序列，一般含有poly(A)尾，在插入點(diǎn)可產(chǎn)生721bp的正向重復(fù)。中間往往含有ORF，但因其無啟動子，一般不能表達(dá)。 無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又可分為兩類：LINES（lone interspersed sequence）和非病毒超家族。第46頁，共93頁。LINES家族 LINES家族具有逆轉(zhuǎn)錄酶基因，但缺少LTR，因此，它們可以被認(rèn)為是逆轉(zhuǎn)錄病毒超家族的遠(yuǎn)源成員。它們衍生自RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。基因組中這一家族的少數(shù)成員能自發(fā)轉(zhuǎn)座，而其他成員由于存在突變，只有在自主元件的反式作用下才能轉(zhuǎn)座。

23、哺乳動物基因組中最常見的LINES稱為L1，其典型成員長6500bp，以富含A的序列終止。它全長包含兩個讀框，分別稱為ORF1和ORF2，ORF1編碼一個核酸結(jié)合蛋白，ORF2編碼一個具有逆轉(zhuǎn)錄酶和核酸內(nèi)切酶雙重活性的蛋白質(zhì)。第47頁，共93頁。非病毒超家族 非病毒超家族是由細(xì)胞中的RNA分子經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。這類轉(zhuǎn)座子并不編碼有轉(zhuǎn)座功能的蛋白質(zhì)，它們是部分或完全的細(xì)胞RNA分子的DNA拷貝。除了rRNA不能產(chǎn)生無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子外，mRNA和tRNA都可以產(chǎn)生無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。由mRNA產(chǎn)生的這種轉(zhuǎn)座子成為假基因，假基因不含內(nèi)含子，含有poly(A)尾。這一家族最著名的成員是SINES，

24、它們衍生自RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄物。第48頁，共93頁。人基因組中各種轉(zhuǎn)座子的比例第49頁，共93頁。無LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)理第50頁，共93頁。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座與基因表達(dá) 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座可以起到一種開關(guān)作用而影響基因的表達(dá)，引起暫時性的突變。也有一些轉(zhuǎn)座子由于喪失了從染色體上割離下來的能力，而使突變成為永久性的。因轉(zhuǎn)座是經(jīng)常發(fā)生的，所以由轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座引起的突變最顯著的特點(diǎn)是其不穩(wěn)定性。 第51頁，共93頁。Ac-Ds 轉(zhuǎn)座使玉米籽粒顏色產(chǎn)生變異第52頁，共93頁。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座與基因表達(dá) 當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到一個基因的啟動區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)，會抑制或促進(jìn)該基因的表達(dá)。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到一個基因的編碼區(qū)，往往會使該基因編碼

25、的蛋白質(zhì)失去功能。比如說一個轉(zhuǎn)座子跳到一個參與花色素苷生物合成的基因中，就可能產(chǎn)生一個突變體，使本來開紫花的植物變成開白花。在一般情況下，由轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的突變體不太穩(wěn)定，因此，一旦該轉(zhuǎn)座子從該基因中轉(zhuǎn)移走，又可以恢復(fù)開紫花的表型。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座若發(fā)生在性細(xì)胞中，可以產(chǎn)生較穩(wěn)定的突變體后代，由開紫花的親本變成開白花的子代。若轉(zhuǎn)座發(fā)生在體細(xì)胞中，則可以開出不同顏色的花，甚至在一朵花上出現(xiàn)不同顏色的花瓣。 第53頁，共93頁。轉(zhuǎn)座頻率 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座有一定的頻率，細(xì)菌中的轉(zhuǎn)座頻率為每世代細(xì)胞105107，切除頻率為每世代細(xì)胞1061010。果蠅Copia的轉(zhuǎn)座頻率為每世代細(xì)胞103104。第54頁，共

26、93頁。七、DNA重組1. DNA重組的定義和意義 DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（genetic recombination），也叫DNA重組。DNA重組廣泛存在于各類生物。真核生物基因組的遺傳重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時同源染色體之間的交換（Crossover）。細(xì)菌及噬菌體的基因組為單倍體，來自不同親代的兩組DNA之間可通過多種形式進(jìn)行遺傳重組。第55頁，共93頁。 DNA重組對生物進(jìn)化起著關(guān)鍵的作用。生物進(jìn)化是生物隨時間發(fā)生變化和多樣化的過程。生物進(jìn)化以不斷產(chǎn)生的可遺傳變異為基礎(chǔ)。然而，突變的機(jī)率很低，而且多數(shù)突變是有害的。如果生物只有突變沒有重組，在積累優(yōu)勢突變的

27、同時，不可避免地積累許多難以擺脫的不利突變，有利突變將和不利突變一起被淘汰，新的優(yōu)良基因就可不能出現(xiàn)。重組的意義在于，它能夠迅速增加群體的遺傳多樣性（diversity），通過優(yōu)化組合積累有利的突變。遺傳重組的意義第56頁，共93頁。遺傳重組的意義 遺傳重組系統(tǒng)的功能隨它們的機(jī)制而變化，包括在特異DNA修復(fù)系統(tǒng)中的作用，在DNA復(fù)制中的特異活性，某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，在真核細(xì)胞分裂期間促進(jìn)染色體分離，維持遺傳多樣性，和在胚胎發(fā)育期間實(shí)現(xiàn)程序性遺傳重排。 第57頁，共93頁。DNA重組的類型DNA重組主要包括三種類型：同源重組（homologous recombination）位點(diǎn)特異重組（sit

28、e-specific recombination）轉(zhuǎn)座重組（transpositional recombination）第58頁，共93頁。2. 同源重組 同源重組也叫一般性重組（general recombination ），它包括任何兩個DNA分子（或同一個分子的兩個片段）之間的遺傳交換。發(fā)生交換的兩個分子或同一分子的兩個片段之間有一段近乎相同的序列（同源區(qū)），不論這個序列的具體堿基序列是什么，只要這兩段DNA序列相似就可以發(fā)生。這兩個同源區(qū)通過配對、鏈斷裂和再連接，產(chǎn)生片段交換。第59頁，共93頁。同源重組對同源序列的要求 DNA同源重組是一個十分精確的過程，哪怕只有一個核苷酸的差錯都會

29、導(dǎo)致基因失活。同源重組的分子基礎(chǔ)是鏈間的堿基配對，通過堿基配對才能找到正確的位置，進(jìn)行鏈的交換。實(shí)驗(yàn)表明，兩DNA分子必須具有75bp以上的同源區(qū)才能發(fā)生同源重組，同源區(qū)小于此長度將顯著降低重組率。同源區(qū)并不要求完全相同，少量的序列差異也可以進(jìn)行同源重組。第60頁，共93頁。減數(shù)分裂中的同源重組 在減數(shù)分裂前期，參與聯(lián)會的同源染色體實(shí)際上已復(fù)制成兩條染色單體，從而出現(xiàn)由4條染色單體構(gòu)成的四聯(lián)體。在四聯(lián)體的某些位置，非姊妹染色單體之間可以發(fā)生交換。第61頁，共93頁。細(xì)菌中同源重組的意義 在細(xì)菌中，同源重組主要發(fā)生在DNA修復(fù)過程，稱為重組DNA修復(fù)。它通常是指對DNA損傷位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制叉重建。在

30、接合（交配）期間，當(dāng)染色體DNA從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞時，也能夠發(fā)生同源重組。接合期間的重組雖然很少在野生型細(xì)菌中發(fā)生，但卻產(chǎn)生了遺傳多樣性。 第62頁，共93頁。細(xì)菌中同源重組的意義 細(xì)菌可以通過多種途徑進(jìn)行細(xì)胞間基因轉(zhuǎn)移，并通過基因重組以適應(yīng)隨時改變的環(huán)境。細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移主要有四種機(jī)制：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合。 F+ 細(xì)胞的 F 因子通過接合可將供體大腸桿菌的染色體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中（轉(zhuǎn)移的也可能是部分染色體），供體染色體DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，可與受體染色體發(fā)生同源重組，增加受體細(xì)胞的遺傳多樣性。第63頁，共93頁。Holliday模型 Robin Holliday于1964年提出一個

31、解釋同源重組的模型，在這個模型中，兩個同源染色體DNA排列整齊；一個DNA的一條鏈斷裂并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成連接分子，稱為Holliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體。第64頁，共93頁。Holliday模型 第65頁，共93頁。Holliday模型的缺點(diǎn) Holliday模型能夠較好地解釋同源重組現(xiàn)象。但該模型認(rèn)為進(jìn)行重組的兩個DNA分子在開始時需要的對應(yīng)鏈的相同位置上發(fā)生斷裂，這是很難設(shè)想的?，F(xiàn)在認(rèn)為，同源分子中的一個分子需要雙鏈斷裂才能啟動與另一個分子之間發(fā)生重組。同源重組是減數(shù)分裂時同源染色體聯(lián)會的原因，而不是

32、結(jié)果。第66頁，共93頁。DNA雙鏈斷裂啟動同源重組 這個模型有四個關(guān)鍵特征。同源染色體對齊。一個DNA分子的雙鏈斷裂被核酸外切酶擴(kuò)大，在斷裂端產(chǎn)生3突出的單鏈（圖中步驟1）。暴露的3末端侵入完整的雙鏈DNA，然后分支移動（branch migration）和復(fù)制產(chǎn)生一對交換結(jié)構(gòu)，稱為Holliday連結(jié)體（Holliday junctions）（圖中步驟2到4）。兩個交換斷裂產(chǎn)生兩個完整的重組產(chǎn)物（圖中步驟5）。 第67頁，共93頁。DNA雙鏈斷裂啟動同源重組第68頁，共93頁。DNA雙鏈斷裂啟動同源重組第69頁，共93頁。同源重組時的分支移動第70頁，共93頁。Holliday中間體的電鏡

33、照片 A Holliday intermediate formed between two bacterial plasmids in vivo, as seen with the electron microscope. The intermediates are named for Robin Holliday, who first proposed their existence in 1964.第71頁，共93頁。重組需要多種酶及其它蛋白質(zhì)的作用 從原核生物和真核生物中已經(jīng)分離出了促進(jìn)同源重組各步驟的酶。在大腸桿菌中，recB、recC和recD基因編碼RecBCD酶，它具有解旋酶和核

34、酸酶兩種活性。RecA蛋白促進(jìn)同源重組所有的重要步驟：兩個DNA配對，形成Holliday中間體，分支移動。RuvA和RuvB蛋白（修復(fù)UV損傷）形成一個復(fù)合物結(jié)合到Holliday中間體上，取代RecA蛋白，促進(jìn)以比RecA更高的速度分支移動。特異裂解Holliday中間體的核酸酶（常稱為解離酶）已經(jīng)從細(xì)菌和酵母中分離出來了。RuvC蛋白是大腸桿菌中至少兩種這樣的核酸酶中的一種。第72頁，共93頁。RecBCD酶的作用 RecBCD酶結(jié)合到線性DNA的斷裂端，沿著雙螺旋移動，解開并降解DNA，這是與ATP水解相偶聯(lián)的反應(yīng)。當(dāng)它和一個稱為chi的序列（GCTGGTGG）相互作用時，酶活性被改變

35、。從這個點(diǎn)，具有3末端的鏈的降解逐漸減緩，但具有5末端的鏈的降解加速。這個過程產(chǎn)生了一段具有3末端的單鏈突出。 第73頁，共93頁。RecBCD酶的作用第74頁，共93頁。Chi位點(diǎn)與重組頻率的關(guān)系 在大腸桿菌基因組中散布的1009個chi序列，使得chi位點(diǎn)1000bp范圍內(nèi)重組的頻率增加了約5-10倍。隨著離chi位點(diǎn)距離的增加，重組頻率下降。在其它幾種生物中也鑒別出了增加重組頻率的序列。 第75頁，共93頁。RecA蛋白的作用 RecA結(jié)合到缺口處的DNA單鏈部分上，然后裝配成的纖絲迅速覆蓋到鄰近的雙鏈部分。RecF、RecO和RecR蛋白調(diào)節(jié)RecA纖絲的裝配和拆卸。 表示RecA纖絲

36、重組活性的一個有用模型是體外DNA鏈交換反應(yīng)。首先RecA結(jié)合到DNA的一條單鏈上，裝配成核蛋白纖絲。RecA纖絲與同源雙鏈DNA結(jié)合并對齊，然后在兩個DNA分子之間發(fā)生鏈交換，產(chǎn)生雜合DNA。交換以6bp/s的速率進(jìn)行，相對于RecA纖絲中的單鏈DNA以53的方向前進(jìn)。這個反應(yīng)能夠涉及三或四條鏈。在涉及四條鏈時，就會形成Holliday中間體。第76頁，共93頁。RecA蛋白與單鏈DNA組成核蛋白纖絲右手螺旋每一圈含6個RecA蛋白，紅色表示其中一個RecA蛋白單體。第77頁，共93頁。RecA介導(dǎo)的DNA鏈交換模型第78頁，共93頁。體外RecA促進(jìn)的鏈交換反應(yīng)第79頁，共93頁。體外Re

37、cA促進(jìn)的鏈交換反應(yīng)第80頁，共93頁。同源重組中其它酶的作用 一旦Holliday中間體形成，還需要一批宿主的酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶、RuvAB分支轉(zhuǎn)移蛋白、解離酶、其它核酸酶、DNA聚合酶和及DNA連接酶）來完成重組。大腸桿菌的RuvC蛋白（Mr20,000）裂解Holliday中間體，產(chǎn)生全長的、不分支的染色體產(chǎn)物。第81頁，共93頁。轉(zhuǎn)座子間同源重組導(dǎo)致染色體畸變第82頁，共93頁。3. 位點(diǎn)特異重組 位點(diǎn)特異重組事實(shí)上發(fā)生在每一個細(xì)胞里，在不同的物種中作用差別非常大。作用包括調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)和在胚胎發(fā)育中或在某些病毒和質(zhì)粒的復(fù)制循環(huán)中促進(jìn)程序性DNA重排。每一個位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)由重組酶和一段短的、特異的DNA序列組成，這個特異序列是重組酶的作用位點(diǎn)（重組位點(diǎn)）。第83頁，共93頁。位點(diǎn)特異重組的機(jī)制 重組酶識別和結(jié)合到兩個不同DNA分子或同一個DNA分子的兩個重組位點(diǎn)上。在每一個位點(diǎn)處一條DNA鏈在位點(diǎn)內(nèi)的特異點(diǎn)斷裂，重組酶在斷裂位點(diǎn)通過磷酸酪氨酸（或磷酸絲氨酸）共價連接到DNA上。暫時的蛋白質(zhì)DNA連接保護(hù)了DNA斷裂的磷酸二酯鍵，使得在后續(xù)的步驟中不需要消耗高能輔因子如ATP。斷裂的DNA鏈被重新連接到新的伴侶上，形成Holliday中間體，蛋白質(zhì)DNA連接轉(zhuǎn)