醫(yī)學(xué)第三節(jié)實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用課件

1、第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)及應(yīng)用第1頁，共34頁。討論實(shí)驗(yàn)步驟總結(jié)配制溶液 溶液顯色 測(cè)量 儀器調(diào)試 記錄數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)處理 報(bào)告結(jié)果第2頁，共34頁。一、樣品的制備 樣品在溶液中測(cè)定，固體轉(zhuǎn)換為溶液溶劑要求：1.對(duì)被測(cè)組分有良好的溶解能力 2.在測(cè)定波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有吸收 3.被測(cè)組分在溶劑中有好的吸收 峰形 4.無毒，不易揮發(fā)，價(jià)格便宜第3頁，共34頁。二、儀器測(cè)量條件的選擇1.波長(zhǎng)選擇 選最大吸收波長(zhǎng)max為測(cè)定波長(zhǎng)選擇原則：最強(qiáng)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng) 作為測(cè)量波長(zhǎng)吸收峰太尖銳，可選用靈敏度低一些的波長(zhǎng)測(cè)量，減少偏差 問題：如何繪制吸收曲線？第4頁，共34頁。2.吸光度范圍的選擇光源不穩(wěn)定、讀數(shù)不準(zhǔn)確、實(shí)驗(yàn)

2、條件偶然變動(dòng) 測(cè)量誤差濃度較大或較小時(shí)，相對(duì)誤差較大選擇A的測(cè)定范圍為0.20.8相對(duì)誤差 問題：如果測(cè)定吸光度過大或過小應(yīng)如何處理？第5頁，共34頁。3.儀器狹縫寬度的選擇 在不引起吸光度減小的情況下，選取最大的狹縫寬度由專業(yè)人員來調(diào)節(jié)！第6頁，共34頁。三、顯色反應(yīng)條件的選擇1.顯色劑及其用量的選擇顯色反應(yīng)：將待測(cè)組分轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì)顯色劑：與待測(cè)組分形成有色物質(zhì)的試劑a.顯色劑的選擇要求：（1）與待測(cè)離子顯色反應(yīng)的產(chǎn)物組成恒定、穩(wěn)定性好、顯色條件易于控制； （2）產(chǎn)物有較強(qiáng)的吸收能力，即大； （3）顯色劑與產(chǎn)物的顏色對(duì)照性好，即吸收波長(zhǎng)有明顯的差別，一般要求 max 60nm。第7頁，共3

3、4頁。 b.顯色劑用量的選擇 方法：固定被測(cè)組分濃度和其他條件，然后加入不同量的顯色劑，分別測(cè)定吸光度A；吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系會(huì)出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。CRabab第8頁，共34頁。2.反應(yīng)的pH （顯色反應(yīng)的重要條件 ）顯色劑為有機(jī)弱酸（或弱堿），介質(zhì)酸度直接影響其解離程度，從而影響顯色反應(yīng)的完全程度。同種金屬離子與同種顯色劑反應(yīng)，可以生成不同配位數(shù)的不同顏色的配合物，如Fe3+與水楊酸在不同pH條件下的配合物pH對(duì)顯色反應(yīng)的影響：第9頁，共34頁。確定pH的方法：固定溶液中待測(cè)組分和顯色劑濃度，改變?nèi)芤?緩沖溶液控制)的酸度(pH)繪制ApH曲線，從中找出平坦

4、部分為pH范圍。ab第10頁，共34頁。顯色（發(fā)色）時(shí)間：顯色反應(yīng)完成所需時(shí)間穩(wěn)定時(shí)間：顯色后有色物質(zhì)色澤保持穩(wěn)定時(shí)間3. 顯色的時(shí)間 a、大多數(shù)顯色反應(yīng)是在常溫下進(jìn)行的，有些反應(yīng)必須在較高溫度下。b、 繪制工作曲線和進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)該使溶液溫度保持一致。 4.顯色溫度第11頁，共34頁。問題 在用鄰二氮菲測(cè)定鐵含量時(shí),操作如下: 往鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入:鹽酸羥胺溶液，搖勻后再分別加入2ml 1.5g/l 鄰二氮菲，5ml 醋酸鈉溶液，用蒸餾水稀釋至標(biāo)線，搖勻.請(qǐng)問:加入鄰二氮菲、鹽酸羥胺、醋酸鈉溶液的作用分別是什么?第12頁，共34頁。討論在鐵標(biāo)準(zhǔn)液和試液中加入鄰二氮菲溶液、鹽酸羥胺溶液與醋

5、酸鈉溶液的作用是什么？ 1、鄰二氮菲的作用 (1)選擇性好 (2)靈敏度高選擇顯色反應(yīng)考慮的因素 (3)生成有色化合物組成恒定,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 (4)對(duì)比度60nm (5)顯色條件下易于控制可見分光光度法：利用測(cè)量有色物質(zhì)對(duì)某一單色光吸收程度來進(jìn)行測(cè)定的。顯色條件第13頁，共34頁。討論2、鹽酸羥胺與醋酸鈉的作用 鹽酸羥胺的作用是將溶液中的Fe3+還原成可與鄰二氮菲反應(yīng)的Fe2+ ，便于測(cè)定溶液中總鐵含量。醋酸鈉溶液的作用是作為緩沖劑，調(diào)節(jié)溶液合適的pH，以保持鄰二氮菲顯色劑的穩(wěn)定性。第14頁，共34頁。小 節(jié)1.波長(zhǎng)選擇2.吸光度范圍的選擇3.狹縫寬度的選擇4.顯色劑及用量的選擇5.溶液pH的

6、選擇 方法相同：均取曲線平坦處專業(yè)人員調(diào)節(jié)0.2-0.8最大吸收波長(zhǎng)第15頁，共34頁。四、參比溶液的選擇參比溶液的類型：1.溶劑參比 試樣溶液組成簡(jiǎn)單，其他組分很少且對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)光幾乎無吸收，顯色劑沒有吸收，采用溶劑最為參比溶液。2.試劑參比 顯色劑或其他試劑在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，按顯色反應(yīng)相同的條件，只是不加入試樣溶液，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。為什么需要使用參比溶液？ 消除溶液中其他成分以及吸收池和溶劑對(duì)光的反射和吸收帶來的誤差，使測(cè)得的吸光度真正反映待測(cè)溶液吸光強(qiáng)度。第16頁，共34頁。3.樣品參比 試樣基體溶液在測(cè)定波長(zhǎng)有吸收，且與顯色劑不起顯色反應(yīng)，按與顯色反應(yīng)相同的條件處理參比，

7、只是不加顯色劑。4.褪色參比 顯色劑、樣品基體都有吸收，可以在顯色劑中加入褪色劑選擇性的與被測(cè)離子反應(yīng)生成無色配合物（不含被測(cè)組分）第17頁，共34頁。主要的幾種干擾情況：1. 共存離子本身有顏色：Fe3+、Cu2+2.干擾物質(zhì)與顯色劑或被測(cè)組分形成更穩(wěn)定的配合物，使顯色反應(yīng)不能進(jìn)行完全3.干擾物質(zhì)與顯色劑形成有色化合物，在測(cè)定條件下有吸收 五、干擾及消除方法第18頁，共34頁。消除方法1.控制酸度 控制酸度使待測(cè)離子顯色，而干擾離子不生成有色化合物。 如：磺基水楊酸測(cè)定Fe3+時(shí)，若Cu2+共存，此時(shí)Cu2+也能與磺基水楊酸形成黃色配合物而干擾測(cè)定。若溶液酸度控制在pH=2.5，此時(shí)鐵能與磺

8、基水楊酸形成配合物，而銅就不能。第19頁，共34頁。2.選擇適當(dāng)?shù)难诒蝿┻x擇掩蔽劑的原則是： 掩蔽劑不與待測(cè)組分反應(yīng)； 掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應(yīng)產(chǎn)物不干擾待測(cè)組分的測(cè)定。3.選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)量波長(zhǎng)4.分離第20頁，共34頁。紫外-可見分光光度法的應(yīng)用第21頁，共34頁。 紫外-可見分光光度法可用于有機(jī)化合物的定性鑒定、結(jié)構(gòu)推斷和純度檢驗(yàn)。1.未知化合物的定性鑒定 定性依據(jù)：吸收光譜的形狀、吸收峰位置、摩爾吸光系數(shù)。 方法：相同條件下，測(cè)定未知物和已知標(biāo)準(zhǔn)物的吸收光譜，對(duì)比圖譜。 目前最常用的標(biāo)準(zhǔn)圖譜：薩特勒標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫一、定性分析第22頁，共34頁。2. 有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)推斷 有機(jī)物不少基團(tuán)

9、(生色團(tuán))，如羰基、苯環(huán)、硝基、共軛體系等，都有其特征的紫外或可見吸收帶，某些特征基團(tuán)的判別 例如：在204nm附近有中強(qiáng)吸收帶，在260nm附近有弱吸收帶且有精細(xì)結(jié)構(gòu)，是苯環(huán)的特征吸收第23頁，共34頁。3.化合物純度檢驗(yàn)化合物在紫外區(qū)沒有明顯的吸收峰，而雜質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，就可以紫外吸收曲線檢測(cè)出該化合物所含的雜質(zhì)。 如乙醇中雜質(zhì)苯測(cè)定第24頁，共34頁。二、定量分析定量分析可見分光光度定量分析紫外分光光度定量分析用于有色物質(zhì)的測(cè)定用于有紫外吸收的物質(zhì)的測(cè)定第25頁，共34頁。單組分的定量分析A.吸光系數(shù)法方法：已知待測(cè)組分吸光系數(shù)，測(cè)定溶液吸光度，代入朗伯-比爾定律公式計(jì)算含量。A

10、 = k b c單組分的定量分析：只要求測(cè)定某一個(gè)樣品中一種組分，且在選定的測(cè)量波長(zhǎng)下，其他組分沒有吸收即對(duì)該組分不干擾。第26頁，共34頁。B.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法濃度已知標(biāo)液Cs，在一定條件下測(cè)得吸光度As待測(cè)液Cx （濃度相近），在相同條件下測(cè)得吸光度為Ax 根據(jù)朗伯-比爾定律： As=kbcs Ax=kbcx cx =（Ax/As）cs 引起誤差的偶然因素較多! 不可靠！ 第27頁，共34頁。C.標(biāo)準(zhǔn)曲線法 方法：1.配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以不含被測(cè)組分空白為參比溶液，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=a+bC。 2.在相同條件下測(cè)定

11、樣品溶液的吸光度，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的回歸方程計(jì)算出濃度。第28頁，共34頁。例題 以鄰二氮菲為顯色劑，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定微量Fe2+，實(shí)驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的吸光度數(shù)據(jù)（見下表），試確定樣品的濃度。溶液標(biāo)準(zhǔn)1標(biāo)準(zhǔn)2標(biāo)準(zhǔn)3標(biāo)準(zhǔn)4標(biāo)準(zhǔn)5標(biāo)準(zhǔn)6樣品濃度C/(10-5molL-1）1.00 2.00 3.00 4.00 6.00 8.00 Cx吸光度 A0.1130.2120.3360.4340.6690.8680.712第29頁，共34頁。解：以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性處理程序進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程為：A=0.109105C+0.0073, 相關(guān)系數(shù)r2=0.

12、9994標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求，將待測(cè)溶液吸光度代入回歸方程，的試樣濃度為:a，截距b，斜率相關(guān)系數(shù)，接近1線性好，0.999Cx=(A-0.0073)/0.109105 =(0.712-0.0073 )/0.109105 6.5110-5 molL-1第30頁，共34頁。 請(qǐng)大家歸納總結(jié)可見分光光度法和紫外分光光度法的聯(lián)系和區(qū)別。(定義、條件、儀器、應(yīng)用)第31頁，共34頁。 紫外與可見分光光度法比較 可見分光光度法紫外分光光度法定義基于物質(zhì)對(duì)可見光的吸收而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的一類方法基于物質(zhì)對(duì)紫外光的吸收而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的一類方法有色溶液；顯色劑；控制PH;繪制吸收曲線,選擇最大波長(zhǎng)減小干擾;合適的參比液條件繪制吸收曲線,選擇最大波長(zhǎng)；合適的參比液儀器400-780nm,鎢燈,玻璃吸收池200-400nm,氘燈,石英吸收池應(yīng)用一般作