紫杉醇產(chǎn)量影響因素

1、影響紫杉醇生產(chǎn)的因素和提高產(chǎn)量的方法l=Jl=J摘要綜述紅豆杉細胞培養(yǎng)，內(nèi)生真菌培養(yǎng)等方法生產(chǎn)紫杉醇的影響產(chǎn)量的各種因素。并 且列舉一些提高產(chǎn)量的方法。關(guān)鍵詞紫杉醇；生產(chǎn)；產(chǎn)量；方法紫杉醇是一種高效的抗癌藥物，它能與微觀蛋白結(jié)合，促進其聚合，抑制癌細胞的有絲 分裂，阻止癌細胞的無限增殖。目前，人們獲得紫杉醇的途徑主要有：紅豆杉中提取，細胞 培養(yǎng)，微生物發(fā)酵，化學合成等。而紅豆杉中紫杉醇含量非常低，加之該屬植物生長極其緩 慢，因而目前多研究后幾種方法生產(chǎn)紫杉醇。1紅豆杉細胞培養(yǎng)利用紅豆杉細胞培養(yǎng)能夠連續(xù)均勻生產(chǎn)，外界條件影響不大，而且可以在生物反應(yīng)器中 大規(guī)模培養(yǎng)，易于提高產(chǎn)量和進行產(chǎn)物的分離提

2、取純化，是目前工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。 1.1外植體的選擇莖段比離體葉片更易誘導出愈傷組織，帶葉莖段外植體比不帶葉莖段外植體形成愈傷組 織要早些，誘導率也稍高;以樹皮作為外植體誘導效果不佳。紅豆杉樹的品種對外植體愈傷 組織的誘導率和誘導速度也有影響。以云南紅豆衫的誘導率最高，誘導速度也最快，相對而 言東北紅豆衫較差。外植體采樣季節(jié)對愈傷組織的誘導有影響。云南紅豆杉早春取樣的莖段 形成愈傷組織的時間要比秋季取樣早得多，春、夏季取樣的東北紅豆衫莖段形成愈傷組織的 時間、比率均高于秋季取樣，而且形成的愈傷組織顏色較淺.同以紫杉醉含量高的外植體作 為誘導材料，可獲得紫杉醉產(chǎn)量高的細胞系。云南紅豆衫和中國

3、紅豆杉愈傷組織中紫衫醉含 量較高，是獲得紫衫醉高產(chǎn)愈傷組織系的外植體的較佳來源。1.2培養(yǎng)基1.2.1種類外植體的愈傷組織誘導率與培養(yǎng)基種類有關(guān)。在MS培養(yǎng)基上，東北紅豆衫幼葉的誘導 率最高，而在BS培養(yǎng)基上，幼莖的誘導率最高。1N 源培養(yǎng)基中氮源影響紅豆杉愈傷組織的生長和紫杉醉的含量。培養(yǎng)基中NO3-濃度高有利 于紅豆杉愈傷組織的生長.而NH4+濃度高則抑制愈傷組織的生長，但可提高紫衫醉的含量。pH培養(yǎng)基的pH值是影響紅豆杉愈傷組織生長及紫杉醇含量的重要因素。對東北紅豆衫而 言，較高pH值對生長有利，pH值為7.0時愈傷組織生長狀態(tài)最好，但pH值為6.0時愈傷 組織中紫衫醉的含量最高;對南方

4、紅豆杉而言，pH值為5.5時對愈傷組織的生長最為有利， pH值為7.0時紫衫醇的含量最高?？梢?，有利于愈傷組織生長的pH值不同于次生代謝產(chǎn)物 合成所需的適宜pH值。紫衫醉的產(chǎn)量取決于生物盤的增加和其中紫衫醉的含量兩方面的因 素.因此，用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醉時需綜合考慮愈傷組織生長和紫衫醉形成對各種培養(yǎng)條 件的不同要求。1.2.4前體飼喂前體飼喂細胞一方面可以通過增加第五兩來加快反應(yīng)速度和提高產(chǎn)率，另一方面還能夠 反饋抑制分支路徑而促進反應(yīng)順利進行，有效提高紫杉醇產(chǎn)量。苯丙氨酸，苯甲酸，苯甲酰 甘氨酸，甘氨酸，絲氨酸等多種前體，無論在愈傷組織培養(yǎng)還是懸浮培養(yǎng)中均能顯著促進紫 杉醇的合成。苯甲酸可

5、結(jié)合到紫杉醇的側(cè)鏈上，亦或提供苯甲酰基團，促使C-13側(cè)鏈上的 苯基異絲氨酸發(fā)生酰化反應(yīng)。甘氨酸，絲氨酸能夠進入忙草酸途徑，從而促進苯丙氨酸，苯 甲酸的合唱，苯甲酰甘氨酸也可水解為苯甲酰和甘氨酸2部分，從而間接促進紫杉醇的合成。 香葉醇對細胞的生長影響不大，但能夠使紫杉醇的含量和產(chǎn)量大幅度提高。1.2.5添加抑制劑：在中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞添加單菇合成抑制劑,aid烯，松油醇，樟腦.除松油醇外，a 烯、樟腦a烯+松油醇以及a烯+松油醇+樟腦對紅豆杉細胞生長有較大影響，但對紫杉醇的 生物合成都有促進作用.二者同時添加將全面阻止能量和物流過多流向單菇3個旁路途徑， 使更多的能量和物流集中到由單菇合

6、成一菇的途徑中來，從而提高了紫杉醇的產(chǎn)量 1.2.6添加誘導子紫杉醇是一種植物防衛(wèi)素，可以被誘導子所誘導。生物誘導子：茉莉酸甲酯作為細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)中的一種重要物質(zhì)，廣泛參與了植物防御信號的轉(zhuǎn)導 與放大過程.在不同培養(yǎng)時間加入不同濃度的茉莉酸甲酯，均能促進紫杉醇合成，只是增加 量略有不同。茉莉酸甲酯的加入時間和濃度與紫杉醇產(chǎn)量有明顯相關(guān)性，茉莉酸甲醋在對數(shù) 生長期初期至穩(wěn)定期之前加入且濃度為100 umol/ L時，誘導作用顯著?；ㄉ南┧岬恼T導 效果也較好，濃度為5 ug/g時即可將紫杉醇含量提高9. 3倍。且茉莉酸甲酯與花生四烯酸有 明顯的誘導協(xié)同作用。水楊酸(SA )是存在于植物體內(nèi)的重

7、要的酚類物質(zhì)，與植物抗病性密 切相關(guān)。SA介導的信號傳遞途徑與植物抗病性關(guān)系受到廣泛關(guān)注。它作為一種重要的細胞 信使與植物抗毒素，可以誘導呼吸方式從細胞色素呼吸途徑到交替呼吸途徑的轉(zhuǎn)變，為植物 病理反應(yīng)提供物質(zhì)、能量以及信號傳導的基礎(chǔ)。20mg/L水楊酸對紫杉醇促進效果最明顯， 紫杉醇含量可提高10倍以上。2 非生物誘導子：非生物誘導子包括化學傷害脅迫(重金屬鹽類、去污劑、乙烯、氯仿、殺真菌劑等)和物 理傷害脅迫(紫外線、輻射、凍融等)。一些重金屬也可作為促進細胞合成與釋放紫杉醇的誘 導子。鑭，鈰能不同程度地提高細胞中紫杉醇的合成與釋放，其中以正二價的鈰離子效果最 顯著。平穩(wěn)期加入稀土有利于生

8、物量的積累，但對每升發(fā)酵液中紫杉醇總量而言，對數(shù)期加 入稀土化合物效果更好。在指數(shù)生長期末紅豆杉培養(yǎng)細胞對Cu、+誘導處理具有最強的反應(yīng) 能力.培養(yǎng)基中添加濃度在0.5100 umol/ L之間的CuCl2，均能誘導紫杉醇的合成。硫酸釩 酞的加入可以顯著促進細胞中紫杉醇的形成.其中以10 mg/ L處理效果最好。1.2.7植物生長調(diào)節(jié)因子在培養(yǎng)液中添加不同種類和濃度的生長激素對懸浮細胞的生長和紫杉醇的產(chǎn)量都有一 定的影響。NAA和BA的配比對愈傷組織生長及生產(chǎn)紫杉醇的影響.表明隨著BA濃度的增加，愈 傷組織的生物量呈現(xiàn)下降趨勢，相比之下，NAA對愈傷組織的影響較小。綜合考慮紫杉醇 的總產(chǎn)量，N

9、AA和BA的濃度各為1 mg/ L的配比為最佳激素比例。低濃度的2, 4-D(0. 51. 0 mg/ L)比較適合于紫杉醇的合成，而較高濃度的2,4刁(1.0 2. 5 mg/ L)則比較適合于細胞 的生長.綜合2方面的因素，較佳的2, 4-D濃度為1. 05mg/ L。使用IAA比2, 4-D更能有效 地提高紫杉醇的產(chǎn)量，而使用NAA時紫杉醇的產(chǎn)量變化與使用2, 4-D的結(jié)果相差不大。當 細胞分裂素與生長素聯(lián)合使用于細胞b.浮培養(yǎng)時則具有更好刺激生長的效果.對紫杉醇生產(chǎn) 而言，IA A與BA結(jié)合使用是最好的組合，紫杉醇的產(chǎn)量可達14. 78 士 0. 86 mg/ L。此外， 2, 4-D

10、或IBA與BA的組合也能有效地提高紫杉醇產(chǎn)量.為了達到高產(chǎn)量紫杉醇的日的，適 當?shù)卣{(diào)整生長素與分裂素的比例至關(guān)重要.適度的2, 4-D和KT比例可以改善細胞生長狀態(tài) 和提高紫杉醇產(chǎn)量。1.3生物反應(yīng)器目前主要的生物反應(yīng)器類型有:機械攪拌生物反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器，流化床反應(yīng)器， 以及膜反應(yīng)器。但是目前這一類反應(yīng)器都是在參照微生物發(fā)酵技術(shù)方面發(fā)展起來的。真正適 用于培養(yǎng)植物細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物特別是紫杉醇能達到工業(yè)化生產(chǎn)的生物反應(yīng)器還沒有。 由S.H.Son等研制的一種綜合氣升式和流化床反應(yīng)器特點的發(fā)泡生物反應(yīng)器在培養(yǎng)紅豆杉 胚源細胞株時，發(fā)現(xiàn)在20 L小規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器中培養(yǎng)的基礎(chǔ)在100-500

11、 L反應(yīng)器中的培養(yǎng) 情況具有良好的重現(xiàn)性，能夠大幅提高紫杉醇的產(chǎn)量，在培養(yǎng)27 d后獲得大約3 mg/L的紫 杉醇和74 mg/L的總紫杉烷類物質(zhì)。3 1.4其他因素溫度對紅豆杉細胞的生長與紫杉醇的合成都有顯著影響.細胞的最佳生長溫度是24C， 而在29C培養(yǎng)對紫杉醇的合成最有利?？梢圆扇腋〖毎仍?4C培養(yǎng)21 d，然后升溫到 29C培養(yǎng)積累代謝產(chǎn)物。4光照條件也是影響細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的重要因素。紅豆杉 的懸浮細胞適于在較黑暗的條件下生長。在黑暗條件下細胞生長速度較快，約為光照條件下 細胞生長速度的3倍，紫杉醇的產(chǎn)量也是光照條件下細胞紫杉醇含量的3倍。超聲處理可以 提高紅豆杉細胞紫杉醇

12、的總產(chǎn)量和胞外釋放百分率。5氣體組合也會較大地影響紫杉醇的 含量.根據(jù)紫杉醇的產(chǎn)量，最為有效的氣體混合組成是10%(體積分數(shù))氧氣，0. 5%(體積分數(shù)) 一氧化碳和5*e-6乙烯。2真菌培養(yǎng)紫杉醇產(chǎn)生菌卞要是一些紅豆杉的內(nèi)生真菌.真菌中最高紫杉醇含量為185. 4ug/L，可 見，當前利用微生物發(fā)酵方法產(chǎn)生紫杉醇的量很低，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求.而目，真 菌自身合成紫杉醇的途徑還未見報道，自身是否存在紫杉醇的合成途徑還需進一步研究探索. 此生產(chǎn)方法的前景還不明朗.3化學合成法紫杉醇結(jié)構(gòu)復雜，母核有9個乎性中心，因此應(yīng)有2048個非對映異構(gòu)體。采用全合成 方法不僅步驟多而且由于眾多異構(gòu)體，分

13、離提純困難，難以得到高純度紫杉醇。采用化學半 合成方法，受到以下幾個因素影響：一是合成原料在植物中含量不高，提取分離成本較高。 二是每一步反應(yīng)得率低，而目有時會碰到選擇性較差的問題.所以，無論是全合成還是半合 成，都難以應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。64提高紫杉醇產(chǎn)量方法4.1篩選高產(chǎn)細胞株系利用基因工程技術(shù)提高紫杉醇含量取決于兩個條件:紅顯杉遺傳轉(zhuǎn)化和植株再生體系的 建立及紅顯杉中與紫杉醇生物合成相關(guān)基因的克隆。7紫杉醇的生物合成過程已基本闡明:二甲基丙烯基焦磷酸合成香葉基香葉基焦磷酸，通 過紫杉二烯合成酶，后者合成紫杉4(20)，11(12)-二烯，通過P450單加氧酶催化，生成紫杉 -4(2

14、0)，11(12)-二烯-5a-醇，在紫杉二烯-5a-醇-O-乙酞轉(zhuǎn)移酶作用下，合成乙酸紫杉一4(20),11(12)-二烯-5a-酯，再生成10-去乙酞巴卡亭III，再在10-去乙酞巴卡亭III -10-O-乙酞 轉(zhuǎn)移酶催化下生成巴卡亭III，巴卡亭III在巴卡亭III -13-0-苯基異絲氨酸轉(zhuǎn)移酶作用下和苯 基異絲氨酸生成去苯甲酞紫杉醇，去苯甲酞紫杉醇在去苯甲酞紫杉醇N 一苯甲酞轉(zhuǎn)移酶作 用下最后生成紫杉醇。在紫杉醇的合成代謝中有幾類重要的與合成速度有關(guān)的限制酶:紫杉 二烯合成酶和細胞色素P450單加氧酶。這些酶催化的反應(yīng)都可以作為利用基因工程方法提 高紫杉醇產(chǎn)量的重要靶點。通常用分離和

15、克隆的關(guān)鍵酶的基因加上強的啟動子或者經(jīng)過修飾后，構(gòu)建在質(zhì)粒載體 上，通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到紅豆杉基因組中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因模式紅豆杉植株或者紫杉醇高產(chǎn)細 胞系。或者是通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅豆杉枝葉或愈傷組織得到毛狀根或冠瘦組織，用毛狀根 系統(tǒng)和冠瘦組織來生產(chǎn)紫杉醇。84.2內(nèi)生真菌發(fā)酵4.2.1菌種改良誘變：常規(guī)誘變改良菌種，利用紫外線，EMS，Co, NTG等誘變劑。而后，采用原生 質(zhì)體誘變及原生質(zhì)體融合技術(shù)也能大幅度提高內(nèi)生真菌紫杉醇含量。9基因工程:一是將從紅豆杉樹中分離到的紫杉醇生物合成過程中的限速酶的基因轉(zhuǎn)入到 紫杉醇產(chǎn)生菌體內(nèi)，提高關(guān)鍵酶的表達量.進而提高紫杉醇的合成能力。二是從產(chǎn)紫杉醇的

16、內(nèi)生真菌細胞中分離出產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵酶基因并將其導入微生物體內(nèi)，利用其它真菌甚至細 菌、酵母菌構(gòu)建新的紫杉醇高產(chǎn)上程菌株來生產(chǎn)紫杉醇。4.2.2優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件通過添加碳源、氮源和前體物、特殊的誘導子、抑制劑等物質(zhì)借助代謝途徑上程的研究 來提高真菌紫杉醇的合成量。105結(jié)語迄今為止，雖然在實驗室中已對紫杉醇的生產(chǎn)做了很多工作，但離工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)還有相 當大的距離，主要原因在于缺乏關(guān)于紫杉醇生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究，如生物合成途徑、關(guān)鍵酶調(diào)控 等等了解不夠。因此，今后要進一步探討影響紫杉醇生物合成的因子，特別是要加強對紫杉 醇的生物合成途徑的研究，促使這一藥用植物資源的研究與開發(fā)早日實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生

17、 產(chǎn)，造福廣大癌癥患者。參考文獻E陳曉光，李曉樓.利用細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇的研究進展.四川職業(yè)技術(shù)學院.四川職業(yè) 技術(shù)學院學報.2007.17(2):107109.李恒赫，楊坤.誘導子對紅豆杉培養(yǎng)細胞紫杉醇產(chǎn)量的影響.北京師范大學生命科學學院. 生物學通報.2006.41(6):5557.國胡凱，何穎，祝順琴,談鋒,唐克軒.紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇研究進展.西南師范大學 生命科學學院.復旦大學遺傳工程國家重點實驗室.天然產(chǎn)物研究與開發(fā).2003.5:471474.4 Choi H K, Kirn S I, Son J S, et a Enhancement of paclitaxel p

18、roduction by temperature shift in cell suspension cultures of tax us chinensis J. Enzvme and Microbial Technology, 2000, 27: 593598 張,余斐,王傳貴等.超聲波對紅豆杉懸浮細胞生長及紫杉醇釋放的研究J.生物技術(shù),2001,11(2):1417.Son SH, Choi SM, Lee YH, et al. large-scale growth and taxane production in cell cultures of Taxus cuspidata(Japanese yew) usinga novel bioreactor.Plant Cell Reports,2000,19(6):628633.李先良，趙志常.紫杉醇生產(chǎn)方法的研究.荊門職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院