蛋白質活性測定方法

1、核糖核酸酶(RNase )的活性測定溶液的配制：0.1 mol/L pH 5.0的乙酸緩沖溶液：稱取5.78 g CH3COONa,加入1.7 mL CH3COOH,用蒸餾水稀釋至500 mL。0.05 % RNase酵母溶液：稱0.05 g RNase酵母，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸緩 沖溶液溶解并稀釋至100 mL。測活方法：用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中， 加入一定量的樣品RNase A溶液，迅速搖勻，以蒸餾水為參比，在300 nm波長 下每隔30秒測一次吸光值，共讀3分鐘，得到一組對應于時間t(min)的At值。 當樣品管反應3

2、小時后再測定300 nm處的吸光值Af, Af為最終的光吸收，分別 求得一組對應于t的log(At-Af),以log(At-Af)對時間t作圖應得到線性關系，畫出 直線。求出直線斜率的數值S，將S帶入標準曲線，求得活性回收率。將S帶入 下列公式中，可求出酶的活力。單位/ mg = S x (-2.3) x4 / (樣品管中含酶的數量)胰凝乳蛋白酶(a-Chy)活性測定用胡梅爾(Hummel)法測定a-胰凝乳蛋白酶：(1)原理：a-胰凝乳蛋白酶優(yōu)先催化水解結合有氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸的L-異構體)的肽鍵。我們可以通過在256 nm處測定吸光度增大值的辦 法來測定反應的速度。苯甲酰-

3、L-酪氨酸乙酯的水解反應引起吸光度的增大。 定義：一個凝乳蛋白酶單位相當于在pH值為7.8,溫度為25 C時，每分鐘 水解1四mol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。試劑配置方法：Tris緩沖液(pH: 7.8)取0.969 g三(羥甲基)氨基甲烷和1.47 mg二水氯化鈣溶于 80 mL蒸餾水中，用1 N的鹽酸將pH值調至7.8，并定容至100 mL。鹽酸(HCl): 0.001 moL/L酶溶液：先用鹽酸溶解酶，使溶液濃度達到1 mg/mL，然后再用鹽酸稀釋，使 最終濃度達到0.51.0 U/mL。底物溶液：取33.5 mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50 %的甲醇(63 mL甲

4、醇與50mL蒸餾水混合)，定容至100 mL。操作步驟：用移液管將1.5 mL Tris緩沖液和1.4 mL底物溶液滴入一只1cm 比色皿，并加熱至25C，加0.10 mL酶溶液，搖勻。用分光光度計(256 nm)測定 反應混合物的吸光度，在約5.0 min內每隔1.0 min讀取吸光度一次，直到每分 鐘吸光度的增大值達到穩(wěn)定為止。計算用以下公式計算酶的活性：=U/mg x 3E 2560.964 x E式中：E256在256 nm處測得的每分鐘內吸光度的增大值 E w一每0.10 mL所用酶液中含酶的重量(mg)0.9641 pmol BTEE 的吸光度(256 nm 處)3一反應液的總體積

5、胰蛋白酶(Trypsin )的活性測定用施韋爾特-竹中(Schwert & Takenaka )法測定胰蛋白酶3:原理：胰蛋白酶將N-苯?；?L-精氨酸從BAEE中釋放出來，用分光光度計于 253 nm處跟蹤測定由該反應引起的吸光度增大情況。定義：一個胰蛋白酶單位相當于在規(guī)定條件下每分鐘使吸光度增大0.001時所 需的酶量。試劑配置方法：底物溶液：取30.9 mg BAEE，280 mg二水氯化鈣和566 mg三羥甲基甲烷溶 于70 mL蒸餾水中，將pH值調至7.6。定容至100 mL。鹽酸(HCl)： 0.001 mol/L酶溶液：酶用0.001 N鹽酸溶解。1.0 mL配制酶溶液中應含有1

6、50 U左右。操作步驟：用移液管將2.8 mL底物溶液滴入1cm比色皿，調溫至25 C。添 加0.20 mL酶溶液，混合。用分光光度計于253 nm處以蒸餾水為參比測定吸光 度，直至每分鐘吸光度增大值達到恒定為止。計算：用以下公式計算活性：=U/mgE 353 0.001 x E式中E 253每分鐘內253 nm處吸光度的增大值0.001一個酶單位每分鐘使吸光度增大0.001Ew0.2 mL所用的酶溶液中含酶的重量(mg)Lys活性的測定取溶壁球菌干菌粉少許，加入少量0.067 mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.2)，用玻璃 棒研磨勻漿，再加入磷酸緩沖液至OD值為0.6-0.8即可。用移液管移

7、取3.0 mL 配置好的溶壁球菌菌液于比色皿中，加入一定量的Lys溶液(酶量在100 ug左右)， 迅速搖勻，以蒸餾水為參比，在450 nm的波長下每隔30秒測一次吸光值，共讀 3分鐘，以吸光度對時間作圖，取最初線性部分，其斜率即為吸光度值的變化率。 在以吸光度值的變化率對加入標準蛋白的質量作圖，用同樣的方法測定樣品的吸 光度值的變化率，依據標準曲線求得蛋白的絕對量或濃度，與同時對照的標準蛋 白活性絕對值或濃度比較，便可計算出活性回收率。中國生物制品標準化委員會編.中國生物制品規(guī)程M.北京：化學工業(yè)出版社， a-Amy活性的測定溶液的配制：0.02mol/L磷酸緩沖液(PH7.0)：稱取1.8

8、g磷酸氫二鈉和1.0g磷酸二氫鉀，用 水溶解后定容至1L。0.1%淀粉溶液：稱取100mg可溶性淀粉與50mL燒杯中，加少量蒸餾水制成 糊狀，然后轉移到盛有80mL0.01mol/L氫氧化鈉的150mL燒杯中煮沸，冷卻后 傾入100mL容量瓶中，用0.01mol/L氫氧化鈉稀釋至刻度。0.005mol/L碘液:稱取3g碘化鉀和1.3g碘用水溶解后，稀釋至0.05mol/L碘液， 然后再稀釋10倍。標準酶液：準確稱取1.0mg高純度a-Amy于離心管中，加入1mL水，溶解后， 于12000RPM離心5分鐘，上清液轉移到另一離心管中備用。用時稀釋100倍。活性測定取7支比色管，用移液管準確加入3.0mL0.1%淀粉溶液，5.0mL磷酸緩沖液，然 后分別加入稀釋標準酶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.