實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用課件

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(Real time Quantitative PCR)講 座 提 綱 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 實(shí)時(shí)原理 常 規(guī) PCR技術(shù)： 對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)定量PC

2、R技術(shù)： 利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 定量原理介紹三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖： 橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集熒光基團(tuán)熒光檢測元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -熒光閾值熒光信號閾值 （threshold ）： 前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 熒光域值的缺

3、省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99 真正的信號:熒光信號超過域值實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定義： PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) value 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 -Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 定量原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：

4、 X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - 定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們設(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量實(shí)時(shí)熒光定量PCR

5、原理 - 標(biāo)準(zhǔn)曲線 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量確定未知樣品的 C(t)值 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 絕對定量25講 座 提 綱 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan

6、 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原理 - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記QQR實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green 法 工作機(jī)理 SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理5353SGNo EmissionSGSGSGExcitat

7、ionSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitation實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析溫度熒光強(qiáng)度TmTm值：DNA解鏈一半時(shí)的溫度實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)-dIdTTmSYBR Green 法 融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA conce

8、ntrationSYBR Green 法 定量原理 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同天為時(shí)代公司利用SYBR Green 法定量檢測樣品DNASYBR Green 法 應(yīng)

9、用范圍 起始模板的測定 基因型的分析 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。SYBR Green 法 優(yōu)缺點(diǎn) 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNA 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜優(yōu) 點(diǎn) 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件 對引物特異性要求較高缺 點(diǎn)與目標(biāo)序列互補(bǔ)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法2 -TaqMan法TaqMan-水解型雜交探針 5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Qu

10、encher, Q) 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法 工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和

11、探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同已肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴(kuò)增病毒基因，以TaqMan探針進(jìn)行檢測設(shè)置對照：濃度為106、105 、104 103 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個(gè)，設(shè)陰性和空白對照實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNA 設(shè)計(jì)特異引物 設(shè)計(jì)TaqMan探針并標(biāo)記探針 擴(kuò)增程序結(jié)果：獲取血液樣品中HBV DNA的精確copy數(shù)利用TaqMan法 檢測血液中的HBV數(shù)據(jù)分析分析結(jié)果： HBV DNA的精確copy數(shù)為3.

12、7X105利用TaqMan法 檢測血液中的HBVTaqMan法 應(yīng)用范圍 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 產(chǎn)物鑒定 SNP分析TaqMan法 優(yōu)缺點(diǎn) 對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定 設(shè)計(jì)相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu) 點(diǎn) 只適合一個(gè)特定的目標(biāo) 委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高 不易找到本底低的探針缺 點(diǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信標(biāo))標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素 淬滅劑發(fā)夾型雜交探針Molecular beacon (分子信標(biāo)) 工作原理 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET） 探針與DNA雜交

13、時(shí)產(chǎn)生熒光 -變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光 -延伸過程：不產(chǎn)生熒光 -退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號Molecular beacon (分子信標(biāo)) 應(yīng)用范圍 起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析Molecular beacon (分子信標(biāo)) 優(yōu)缺點(diǎn)高特異性：對目標(biāo)序列 檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu) 點(diǎn) 只能用于一個(gè)特定目標(biāo) 設(shè)計(jì)困難 價(jià)格比較高缺 點(diǎn)講 座 提 綱 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)時(shí)

14、熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品相對定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA拷貝數(shù) 用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 定量方法 絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)曲線 相對定量確定經(jīng)過不同處理的

15、樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因的表達(dá)差異（不同時(shí)相） 2-C（t） 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 TaqMan法舉例TaqMan法研究ERBB2 在乳腺腫瘤 組織標(biāo)本中的表達(dá)差異 TaqMan法舉例 標(biāo)記探針使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量 Fam標(biāo)記目標(biāo)基因探針 VIC標(biāo)記看家基因探針TaqMan法舉例 材料準(zhǔn)備從正常乳腺組織中提取的總 RNA 從乳腺癌組織中提取的 總RNA含 ERBB2 and GAPDH 的質(zhì)粒用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線單雙通道同時(shí)進(jìn)行，獨(dú)立分析 Controlsno RNA：陰性對照RNA + no reverse transcriptase：基因組對照TaqMan法舉例

16、 反應(yīng)程序 RT-qPCR 反應(yīng)程序：50C,30min95C,15min94C,15sec60C,1minplate read10C,foreverEnd35 more timesTaqMan法舉例 癌癥標(biāo)記物表達(dá)Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單雙通道相互驗(yàn)證A.Multiplex ReactionsHealthy RNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65 0.1526.80 0.32B.Singleplex r

17、eactionsHealthy RNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70 0.0326.82 0.24TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定量Copies ng/ l Total RNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB21095 1052213024922.16 XGAPDH95500857301360001308001.45 XTaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 定量分析ERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/

18、136000 = 0.0172492/130800 = 0.019Healthy RNATumor RNA0.01150.0180.018/ 0.011GraphCopies ng/ l Total RNATaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表達(dá)差異HealthyTissueCarc.TissueRelative ExpressionERBB2的表達(dá)差異TaqMan法舉例 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 討論通過RT-qPCR成功檢測了ERBB2基因在不同組織的 表達(dá)差異；在乳腺癌組織中，ERBB2的表達(dá)量是正常水平的1.8倍實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 SYBR Green I法舉例利用SYBR Green 1進(jìn)行GMO定量(

19、SGI) for GMO soy detection SYBR Green I法 GMO概念 轉(zhuǎn)基因生物又稱遺傳修飾生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是經(jīng)基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的生物，包括轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物和轉(zhuǎn)基因動物。 SYBR Green I法 GMO概念1983年：首例轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草1986年：轉(zhuǎn)基因植物首次進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)1994年：首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品Flavr Savr 延熟保鮮轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)入市場1996年至今：轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展期 SYBR Green I法 檢測方法 轉(zhuǎn)基因生物包括了特異的核酸序列，調(diào)控序列、目標(biāo)基因、報(bào)告基

20、因 通過內(nèi)源基因來對每個(gè)樣品DNA進(jìn)行定量（Normalization) 利用插入基因的定量來進(jìn)行GMO含量檢測SYBR Green I法 材料準(zhǔn)備 Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非轉(zhuǎn)基因大豆 從超級市場買來的下列食物用來作為測試樣品： 大豆餅,豆制甜點(diǎn) 和兩個(gè)牌子的大豆粉SYBR Green I法 樣品制備標(biāo)準(zhǔn)品的制備:轉(zhuǎn)基因成分含量分別為 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 轉(zhuǎn)基因大豆實(shí)驗(yàn)樣本 從含大豆成分的樣本中提取DNADNA from Standard/SamplePCR mixGMO primersTUBE 1T

21、UBE 2PCR mixLectin primersSYBR Green I法 引物設(shè)計(jì)Lectin 擴(kuò)增片段長度為318bp 其引物為： 正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3， 反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3EPSPS 擴(kuò)增片段長度為356bp 其引物為： 正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3 SYBR Green I法 C（t）定量 log A/B = logA- logB A: EPSPS GMO

22、 B: Lectin all bean A/B: %GMO%GMOC（t） SYBR Green I法測GMO 數(shù)據(jù)收集與分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線log%GMO對應(yīng)C（t）獲得 熔解曲線分析，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)處理： C（t）EPSPS-C（t）lectin=C（t）處理?xiàng)l件： 假定兩對引物有相同的擴(kuò)增效率并且相互獨(dú)立擴(kuò)增。 SYBR Green I法測GMO 熔解曲線分析Tm = 92oC熔解曲線 Lectin 擴(kuò)增 Tm = 88.5oC熔解曲線 epsps 擴(kuò)增SYBR Green I法測GMO 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1:標(biāo)準(zhǔn)曲線不同轉(zhuǎn)基因成分含量與Ct epsps做標(biāo)準(zhǔn)曲線Cp4-epspsSYBR Green I法測GMO 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2: 樣品的擴(kuò)增曲線LectinepspsFood Sample #2Food Sample #1SYBR Green I法測GMO 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 定量分析Standards/SampleC(t) epspsC(t) Lectin0ND22.60.1ND22.60.528.222.51.027.222.52.026.222.85.024.622.7Soy Dessert24.622.4Soy FlourND22.2Soy Burger24.223.4SYBR