酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗報告

1、酶促反應(yīng)動力學(xué)實驗報告楊恩原實驗?zāi)康模河^察底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響觀察抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響掌握用雙倒數(shù)作圖法測定堿性磷酸酶的Km值實驗原理：一、底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶的催化作用有很大的影響。在一般情況 下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r，酶促反應(yīng)的速度(v)隨底物濃度S的增加而迅速增加，但當(dāng)?shù)孜餄?度繼續(xù)增加時，反應(yīng)速度的增加率就比較小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時反應(yīng)速度達(dá)到一 個極限值(即最大速度Vmax)。底物濃度和反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用米氏方程式來表示 (Michaelis-Menten 方程)即：Ke 十S式中Vmax為最大反應(yīng)速度，Km

2、為米氏常數(shù)，S為底物濃度當(dāng)v=Vmax/2時，則Km=S，Km是酶的特征性常數(shù)，測定Km是研究酶的一種重要方法。但 是在一般情況下，根據(jù)實驗結(jié)果繪制成的是直角雙曲線，難以準(zhǔn)確求得Km和Vmax。若將米 氏方程變形為雙倒數(shù)方程(Lineweaver-Burk方程)，則此方程為直角方程，即：廠 5 Vg以1/V和1/S分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)。將各點連線，在橫軸截距為-1/Km，據(jù)此可算出Km值。本實驗以堿性磷酸酶為例，測定不同濃度底物時的酶活性，再根據(jù)1/v和1/S 的倒數(shù)作圖， 計算出其Km值。二、抑制劑對酶促反映的影響凡能降低酶的活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，成為酶的抑制劑。酶的特異性抑制劑

3、大 致上分為可逆性和不可逆性兩類?？赡嫘砸种朴挚煞譃楦偁幮砸种坪头歉偁幮砸种频取８偁?性抑制劑的作用特點是使該酶的Km值增大，但對酶促反映的最大速度Vmax值無影響。非競 爭性抑制劑的作用特點是不影響S與酶的結(jié)合，故其Km值不變，然而卻能降低其最大速度 Vmax。本實驗選取Na HPO作為堿性磷酸酶的抑制物，確定其抑制作用屬于哪種類型。24實驗步驟：實驗一:底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響試劑(1)(3)(6)(7)(8)(9)O.O1 mol/L 基質(zhì) 液(ml)011111224蒸餡水(ml)4765434201.取試管9支，將L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度:、一號 試劑123456789吸思上表

4、稀釋基質(zhì)液1ml(1)(2)(3)C4)(6)(7)(8)(9)pH 10碳酸鈉緩 沖液(ml)0.90.90.90.90.90.90.90.90.92.另取9支試管編號，做酶促反應(yīng):酶液(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pH10碳酸鈉緩 沖液(ml)010/16HO/1410/1210/1010/810/610/410/23.混勻，37 C水浴保溫5分鐘左右。加入酶液后立即計時，各管混勻后在37 C準(zhǔn)確保溫15分鐘。保溫結(jié)束，立即加入LNaOH ml以中止反應(yīng)。各管分別加入 4-氨基安替比林口1及0.5mol/LNaOH(ml)1.01.01.0.()1.0L01

5、.01.0LO0.3%4-氨基安 替比林(ml)LOLO1.01.01.01.0LO1.0LO。一 5%鐵角1化鉀(ml)2.02,02.02.02.02.02.02.02,0鐵氰化鉀ml。6.充分混勻，放置10分鐘，以管1為對照，于波長510 nm處比色。讀取各管吸光度，做記錄。(酶活性計算及Km值計算) 實驗計算:在37C下保溫15分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出釋放的酚量(ug)，以此計算處各管的酶活性(V)。2.以1 /v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，求出酶的Km值。A00. 1970. 2270. 2340. 2900. 3470. 4070. 4710.

6、 631V08, 1139. 72910.02912.12914.87117.44320, 18627. 0431/v/0. 1180. 1030. 1000. 0800. 0670. 0570. 0500. 0371/S/1.600L400L 200LOGO0, 8000. 6000. 4000. 200Y=+, Km=實驗二:抑制劑對酶促反映的影響管號試劑(2)(3)(4)(5)(6)(7)(9)0.01 ml/L 基質(zhì) 液(ml)011111224蒸餡水(ml)4765434201.取試管9支，將L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度:管號試劑123456789吸取上表稀釋基質(zhì)液Inil(2)(3)

7、(4)(5)(6)(7)(8)(9)O.O4m01/L 磷酸 氫二鈉(ml)0.10.10.10.10.10.10.10.10.1pHlO碳酸鈉緩 沖液(ml)0一 80N0一0.80.80.80.S0.S0.82.另取試管9支，做酶促反應(yīng):3.混勻，37 C水浴保溫5分鐘左右。酶液(ml)0.10.10.10.10A0.10.10.10.1pHlO碳酸鈉緩沖液(ml)010/1610/1410/1210/1010/810/610/410/2加入酶液后立即計時，各管混勻后在37 C準(zhǔn)確保溫15分鐘。保溫結(jié)束，立即加入LNaOH ml以中止反應(yīng)。各管分別加入 4-氨基安替比林口1及鐵氰化鉀ml。

8、0.5mol/LNaOH(ml)KO1,0LO1.0l+0LOL01,0L003%4-K基安 替比林(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.01.00,5%鐵機(jī)化鉀 (ml)2.02.02.02.02.02.02.02.02.06.充分混勻，放置10分鐘，以管1為對照，于波長510 nm處比色。讀取各管吸光度，并計算各管酶活性。實驗計算：以酶活性單位(v)的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，以底物濃度S的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，在方格紙上描 點，并連接各點，求該酶的Km值并與前面未加入抑制劑時測出的Km值作比較。A00, 1540, 1640. 184V06.6007. 0297. 8861/v/

9、0. 1520. 1420. 1271/S/1.6001. 4001. 2000,2140.2550, 3090,4240.6029. 17110. 92913. 24318, 17125. 8000. 1090.0920. 0760. 0550.0391. 0000.8000. 6000. 4000. 200Y=+, Km=實驗分析：通過繪圖及分別計算無抑制劑與有抑制劑時酶的Km值，可發(fā)現(xiàn)，此抑制劑為競爭性抑制劑。通過繪圖發(fā)現(xiàn)，其兩條以1 /v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)的直線截距幾乎相同，而加入抑制劑 后，酶的Km值更大，此為競爭性抑制劑的特征：Vmax不變，Km變大。思考題一、除了雙倒數(shù)作圖

10、外，你能舉出其它能將酶動力學(xué)數(shù)據(jù)做出直線圖的方法嗎海涅斯-沃爾弗作圖法(Hanes-Wolff plot)雙倒數(shù)方程式兩邊同時乘以SV V Vmax max一 Km直線的斜率等于1/Vmax，橫軸截距為-Km伊迪-霍夫斯蒂作圖法(Eadie-Hofstee plot)米氏方程式兩邊均除以S _K V max ms直線的斜率為-Km，直線的縱軸截距為Vmax二、為什么進(jìn)行此種酶動力學(xué)測定時，所用各底物濃度不是按等差遞增在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)速率V對底物濃度S作圖呈矩形雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，反應(yīng)為一級反應(yīng);隨著底物濃度的增高，反應(yīng)速率不再成正比例加速，反應(yīng)為混合級反應(yīng);當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)