細(xì)胞表面分子檢測(cè)和分析

1、關(guān)于細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析第一張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流式在細(xì)胞表面分子檢測(cè)中的應(yīng)用免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)與功能分析例如：T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞等血液系統(tǒng)細(xì)胞表面標(biāo)志的研究例如：急性白血病的初步診斷與檢測(cè)、CD34+造血干細(xì)胞研究、血小板分析輔助診斷相關(guān)疾病等細(xì)胞群體及細(xì)胞表面標(biāo)志變化的監(jiān)測(cè)例如：測(cè)定因試驗(yàn)或臨床治療引起的某些細(xì)胞表面標(biāo)志的變化細(xì)胞表面標(biāo)志構(gòu)成性質(zhì)的分析例如：蛋白、糖蛋白、類脂結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、比例的分析第二張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本來(lái)源實(shí)體組織 新鮮組織、石蠟包埋樣本骨髓穿刺液 體液、灌洗液外周血 全血溶血、PBMC培養(yǎng)的細(xì)胞 原

2、代細(xì)胞 細(xì)胞系：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞 第三張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、新鮮實(shí)體組織樣本的制備 酶消化法。 常用的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等 機(jī)械法。1、剪碎法 2、網(wǎng)搓法 3、研磨法 化學(xué)處理法。 常用試劑：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化過(guò)程外，其余步驟最好在4環(huán)境下操作，提高 細(xì)胞活性。 標(biāo)本制備第四張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 標(biāo)本制備二、全血標(biāo)本的制備 “ABC”溶血（Beckman） 取肝素鈉抗凝的外周血100ul，熒光標(biāo)記完成后，依次加入A液600ul，輕輕振蕩15s；B液260ul, 輕輕振蕩

3、15s；C液100ul, 振蕩10s，免洗上機(jī)檢測(cè)。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素鈉抗凝的外周血與ACK溶血?jiǎng)┗靹?，室溫放?0min，離心去上清，再加入溶血?jiǎng)┤苎磸?fù)23次，至紅細(xì)胞完全溶解。細(xì)胞重懸后，再進(jìn)行熒光標(biāo)記。第五張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)本制備三、外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋成4ml，混勻；（2）將裝有4ml淋巴細(xì)胞分離液的試管傾斜45度，沿試管壁緩慢 加入稀釋血液，勿用力過(guò)大；（3）離心2000r/min，20min，離心后分層，上層為血漿層，中層 為分離液層，底層為紅細(xì)胞層；（4）用吸管將上層與中層之間

4、的單個(gè)核細(xì)胞層吸出，用生理鹽水 洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標(biāo)記。第六張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、貼壁細(xì)胞單細(xì)胞懸液的制備 （1）將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分鐘， 至光鏡下見(jiàn)到貼壁細(xì)胞變圓還沒(méi)有漂浮為止，棄消化 液，加PBS； （2）用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來(lái)，移入離心管中； （3）離心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗兩遍； （5）PBS重懸，將細(xì)胞吹打均勻； （6）熒光標(biāo)記。標(biāo)本制備第七張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記方法直接免疫熒光法 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、省時(shí)；特異性強(qiáng)；結(jié)果判斷較簡(jiǎn)單。間接免疫熒光法 特點(diǎn)：適用

5、范圍廣；抗體相對(duì)便宜；操作費(fèi)時(shí)；易產(chǎn)生非特異性染色，結(jié)果不易判斷。（建議只用于單標(biāo)檢測(cè)）直接、間接混合染色法 染色原則：一般情況下先間接后直接，特殊情況下可先直 接標(biāo)記。推薦！第八張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照 調(diào)節(jié)熒光探測(cè)器放大倍數(shù)，確定帶測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值。常用的有：同型對(duì)照、封閉抗體對(duì)照、陰性細(xì)胞對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 檢測(cè)抗體特異性或確定實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。空白對(duì)照 確定待測(cè)標(biāo)本的基礎(chǔ)熒光域值或檢測(cè)染色方法是否成功。 補(bǔ)償對(duì)照 多色熒光標(biāo)記時(shí)，用于熒光光譜重疊的調(diào)節(jié)。第九張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月同型對(duì)照（Isotype Control）用于消

6、除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色與染色的單克隆抗體 相同種屬來(lái)源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標(biāo)記 相同劑量和濃度 由未免疫動(dòng)物血清純化而來(lái)第十張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙色標(biāo)記熒光補(bǔ)償 口訣：橫平豎直第十一張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光補(bǔ)償對(duì)照分析類型管功能 加入的抗體單色分析1Isotype1-FITC2Sample1,2A-FITC雙色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Is

7、otype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1- PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- ECD1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- ECD1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC- ECD1- PC55Compensation41-FIT

8、C2a-PE1- ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第十二張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)樣本的采集、儲(chǔ)存樣本的染色全血樣本的溶血效果流式實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)置第十三張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣本的采集手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本取材時(shí)，要避免出血或組織壞 死。深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，造成檢測(cè)結(jié)果的誤差。采集靜脈血樣本時(shí)，要避免發(fā)生溶血。收集培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，要注意選擇消化的方法和試劑。第十四張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣本的儲(chǔ)存原則：時(shí)間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫 72小時(shí)EDTA抗凝的標(biāo)本：室溫

9、 24小時(shí)ACD抗凝的外周血：室溫 72小時(shí)ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細(xì)胞、血小板功能檢測(cè)：即刻檢測(cè)單核細(xì)胞表面抗原分析： 1小時(shí)，4嗜酸性粒細(xì)胞表面抗原分析： 24小時(shí)，4淋巴細(xì)胞免疫表型與DNA含量的分析： 72小時(shí)第十五張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣本的染色影響抗原抗體反應(yīng)的因素 電解質(zhì)、反應(yīng)溫度與時(shí)間 、PH值（7.27.4）流式抗體的選擇 根據(jù)流式細(xì)胞儀的類型選擇抗體 抗體應(yīng)用級(jí)別、滴度和使用量的選擇 根據(jù)抗原表達(dá)量選擇抗體第十六張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 溶血，即裂解紅細(xì)胞。它是流式細(xì)胞術(shù)分析白細(xì)胞的先決條件。溶血不好，白細(xì)胞群不能很好分開，溶

10、血好壞直接影響檢測(cè)結(jié)果。因此，必須對(duì)溶血過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格控制。 全血樣本：溶血效果很重要影響溶血的因素：采血過(guò)程 溶血?jiǎng)┑氖褂?實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程第十七張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)語(yǔ)流式細(xì)胞術(shù)的樣本制備沒(méi)有一個(gè)黃金標(biāo)準(zhǔn)最佳樣本制備方法需要根據(jù)具體情況獨(dú)立設(shè)定評(píng)估第十九張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用的熒光染料 熒光染料 激發(fā)波長(zhǎng) (nm) 發(fā)射波長(zhǎng)(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光 綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免

11、疫熒光 紅 PI 488 620 DNA染色 橙紅 PECy7 488 755 免疫熒光 深紅 PerCP 488 670 免疫熒光 深紅第二十張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月參考書籍實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)彩色圖譜王書奎主編 流式細(xì)胞術(shù)基本原理與實(shí)用技術(shù)梁智輝主編臨床流式細(xì)胞分析 王建中主編流式細(xì)胞術(shù) 杜立穎主編第二十一張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)：人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的 檢測(cè)與分析第二十二張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞粒細(xì)胞這三群細(xì)胞分別由具有不同功能的細(xì)胞組成這些細(xì)胞數(shù)量不等，甚至非常稀少這些細(xì)胞表達(dá)不同的標(biāo)記物，是用來(lái)區(qū)分它們的基礎(chǔ)第二十

12、三張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月T淋巴細(xì)胞(CD3+)名 稱功 能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時(shí)升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T

13、細(xì)胞,其表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒(méi)有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時(shí)此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時(shí)升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時(shí)升高 感染時(shí)升高第二十四張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月活化T淋巴細(xì)胞名 稱功 能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+

14、 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過(guò)敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 NK細(xì)胞CD3-CD(16+56)+自身免疫性疾病時(shí)降低, 而病毒感染時(shí)升高 CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆 第二十五張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 實(shí)驗(yàn)分組 同型對(duì)照管或空白對(duì)照(調(diào)節(jié)電壓) 單標(biāo)補(bǔ)償管(電壓不變,調(diào)節(jié)

15、熒光補(bǔ)償) 雙標(biāo)樣本檢測(cè)管第二十六張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.取4只FCM測(cè)量管，編號(hào)blank、CD3、CD4、CD3CD4，各管內(nèi)加入100l新鮮抗凝血；2.直接標(biāo)記法：各管內(nèi)加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗人的單克隆抗體 2ul，充分混勻，閉光孵育2030min；3.溶血。ACK溶血?jiǎng)?加入500l ACK溶血?jiǎng)?，充分混勻，反?yīng)10min, 1500r/min離心5min，去上清，PBS洗1次；若紅細(xì)胞存留較多，再重復(fù)溶血一遍。收集細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟第二十七張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ABC溶血?jiǎng)┡浞紸: 0.12%甲酸 (超純水配置)B:碳酸鈉 6.0g/L ;

16、 氯化鈉14.5 g/L ; 硫酸鈉 31.3g/L (超純水配置)C:多聚甲醛 10.0g/L( PBS配置) 第二十八張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ACK溶血?jiǎng)┡浞?50mM(8.025g)NH4Cl 10mM(1.01g) KHCO30.1mM(0.0372g)Na2EDTA調(diào)PH至7.2-7.4，定容至1000ml無(wú)菌濾膜濾過(guò)，4保存第二十九張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月熒光補(bǔ)償?shù)谌畯?，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月“A門”內(nèi)CD3/CD4的表達(dá)第三十一張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月“A門”位置變化引起的改變第三十二張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)

17、作于2022年6月“A門”位置變化引起的改變第三十三張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月小鼠脾細(xì)胞CD3+/CD4+的表達(dá)第三十五張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流式檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子步驟 1、肝素鈉抗凝血1ml+1ml不完全1640培養(yǎng)液混勻，鋪24孔板1孔。2、PMA（終濃度100ng/ml）+Ionomycin（終濃度1g/ml），375%CO2刺激2h。3、2h后加入阻斷劑Monensin（終濃度2.5mol/ml）混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4、培養(yǎng)結(jié)束后，1500rpm*5min離心去上清。5、表面分子染色。取7只流式檢測(cè)試管

18、，每管中加入100l壓積血，按下列表格內(nèi)容加入抗體染色，4避光染色30min。 管號(hào)檢測(cè)內(nèi)容 熒光抗體 1空白對(duì)照無(wú)2熒光補(bǔ)償管FITC-CD3 5l 3熒光補(bǔ)償管PE-CD8 5l 4熒光補(bǔ)償管Pecy5-CD8 5l 5熒光補(bǔ)償管APC-CD3 5l 6同型對(duì)照APC-CD3 ;Pecy5-CD87測(cè)試管APC-CD3 ;Pecy5-CD8第三十六張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6、 溶血。各管內(nèi)加入1ml BD溶血?jiǎng)?，混勻，室溫避光靜置10min，1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗一次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細(xì)胞。7、 固定。各

19、管內(nèi)加入500l 2%PFA固定劑，4避光固定30min。1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗兩次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細(xì)胞。8、 透膜。各管內(nèi)加入500l 透膜液，4避光1015min。1800rpm*5min離心去上清。9、 封閉。6、7號(hào)管加入25l封閉液。（5l小鼠血清+20l 10%BSA)4避光30min。10、 胞內(nèi)染色。6號(hào)管內(nèi)加入同型對(duì)照抗體FITC-mIgG1和PE-mIgG1各2l； 7號(hào)管內(nèi)加入抗體FITC-IFNg和PE-IL17各5ul。4避光染色30min后透膜液500l/管洗一次,SB染色緩沖液 1ml/管再洗一

20、次。11、上機(jī)檢測(cè)。2%PFA固定劑300l/管混勻重懸4放置待檢。第三十七張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月流式檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞步驟1、采集靜脈血2ml于肝素鈉抗凝管內(nèi)。2、表面分子染色。取7只流式檢測(cè)試管，每管中加入100l抗凝血，按下列表格內(nèi)容加入抗體染色，4避光染色30min。 管號(hào)檢測(cè)內(nèi)容 熒光抗體 1空白對(duì)照無(wú)2熒光補(bǔ)償管FITC-CD4 5l 3熒光補(bǔ)償管PE-CD4 5l 4熒光補(bǔ)償管Pecy5-CD3 5l 5熒光補(bǔ)償管APC-CD3 5l 6同型對(duì)照Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-mIgG17胞內(nèi)同型對(duì)照Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-CD258測(cè)試管Pecy5-CD3; FITC-CD4;PE-CD25第三十九張，PPT共四十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、溶血。 各管內(nèi)加入1ml BD溶血?jiǎng)?，混勻，室溫避光靜置10min，1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗一次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細(xì)胞。4、固定。各管內(nèi)加入500l 2%PFA固定劑，4避光固定30min。1500rpm*5min離心去上清。SB染色緩沖液1ml/管洗兩次，1500rpm*5min離心去上清，混勻沉淀細(xì)胞