黑龍江生物科技職業(yè)學院

1、PAGE 黑龍江生物科技職業(yè)學院生物分離技術實驗指導及報告二五年三月目 錄【實驗一】細胞破碎及梯度離心綜合試驗1【實驗二】用溶劑萃取法提取與精制紅霉素4【實驗三】牛血清白蛋白在雙水相萃取系統(tǒng)中的分配 7【實驗四】等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白10【實驗五】乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠13【實驗六】透析法脫鹽 17【實驗七】硫酸銨分級鹽析分離血清中的主要蛋白質 20【實驗八】活性炭吸附分離色素實驗 24【實驗九】甘露醇的制備及鑒定27【實驗十】胡蘿卜素的柱層析分離31【實驗十一】離子交換色譜分離混合氨基酸35【實驗十二】凝膠柱層析分離蛋白質 39PAGE 43【實驗一】細胞破碎及梯度離心綜合試驗

2、得分：【目的要求】1、了解細胞破碎的基本方法，熟練掌握機械破碎法；2、熟練掌握密度梯度離心的原理及方法?！緦嶒炘怼?、細胞破碎技術（包括機械破碎法： = 1 * GB3 搗碎法 = 2 * GB3 珠磨法 = 3 * GB3 高壓勻漿法 = 4 * GB3 超聲波破碎法；非機械破碎法： = 1 * GB3 凍結-融化法 = 2 * GB3 滲透壓沖擊法 = 3 * GB3 有機溶劑法 = 4 * GB3 表面活性劑法 = 5 * GB3 酸堿法 = 6 * GB3 酶溶法）是提取分離生物藥物的一個基本技術，是學生必須掌握的一項技能。2、溶液的密度自上而下逐漸變化的分布狀態(tài)稱為密度梯度。在超速

3、離心技術中，樣品的密度應分布在溶液的密度梯度范圍內?！緦嶒炗闷贰?、材料土豆、蔗糖。2、試劑0.1mol/L的NaF溶液（將4.2g氟化鈉溶于1000mL水中）、0.01mol/L的鄰苯二酚溶液（將1.1g鄰苯二酚溶解于1000mL水中，用稀氫氧化鈉調節(jié)溶液的pH值為6.0）。3、器具燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、量筒、容量瓶、普通離心機、水浴鍋、不銹鋼鍋?！緦嶒炦^程】1、酶抽提物的制備：步驟：實際操作及現(xiàn)象：拿一塊土豆，洗去上面的泥土。去土豆皮后切成小塊。稱取50g土豆塊放入勻漿器中，再加入氟化鈉溶液50mL。在勻漿器中研磨30s。把勻漿物通過幾層細布濾入一個100mL的燒杯中。加入等體積的飽和硫

4、酸銨溶液，混合后于4放置30min。在4000r/min下離心15min，倒掉上清液。將沉淀物用大約15mL檸檬酸緩沖液溶解，即得該酶粗制品。2、多酚氧化酶的顏色反應將3只干凈的試管編號為1、2、3。按下面的要求制備各管：管1：加入15滴酶抽提液和15滴0.01mol/L的鄰苯二酚溶液，混合均勻。管2：加入15滴酶抽提液和15滴水，混合均勻。管3：加入15滴0.01mol/L的鄰苯二酚溶液和15滴水，混合。把3只試管放于37水浴中。每隔5min震蕩試管并觀察每管中溶液顏色的變化，共反應25min。現(xiàn)象：3、密度梯度離心（1）梯度的制備先制備出蔗糖不同濃度的溶液，濃度間隔相同（20%，40%，6

5、0%，80%），然后每個濃度取相同容量，按濃度依次減小的順序逐個鋪入離心管中即制成不連續(xù)階梯密度梯度。此離心管于2025靜置23h，通過重力作用即成接近線性的連續(xù)密度梯度液。若用細鐵絲輕敲離心管，靜置時間可以縮短至0.51h。溫度低時所需靜置時間較長，溫度高時則較短。為減少對流，靜置后應將離心管置冰浴中備用。（2）密度梯度離心向已成密度梯度的離心管中加入半滴墨汁，放入離心管中離心，3000r/min下離心10min?，F(xiàn)象：【注意事項】1、鄰苯二酚溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。2、制備梯度液時要求緩慢，不能使各濃度液混合在一起?！窘Y論】【思考題】1、水果、蔬菜的褐變是否與本實驗有相關性？2、密度梯度離心與差速

6、離心的區(qū)別？【評語】【實驗二】用溶劑萃取法提取與精制紅霉素得分：【目的要求】1、掌握溶劑萃取法提取微生物藥物的原理和方法2、掌握溶劑萃取法提取微生物藥物的步驟和操作要求【實驗原理】 紅霉素可在堿性條件下溶于乙酸乙酯有機溶劑中，在酸性條件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成鉀鹽沉淀析出。 【實驗用品】 1、材料2g紅霉素軟膏 2、器材量杯、燒杯、布氏漏斗及配套抽濾瓶、培養(yǎng)皿、分液漏斗、鐵架及鐵圈、玻璃棒、鑷子、剪刀、不銹鋼扁匙、PH試紙、濾紙及紡綢布、真空烘箱。 3、試劑乙酸、乙酸乙酯（BA）、飽和食鹽水、異丙醇、乙醇-醋酸鉀溶液（配制方法：取醋酸鉀10g溶于100mL于水乙醇中，配成飽和溶液，現(xiàn)

7、用現(xiàn)配） 【實驗過程】步驟：實際操作及現(xiàn)象：1、取2g紅霉素軟膏，放入燒杯中，加6mL乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯調pH值為 7.2 8.0，抽濾，得澄清濾液，供下一步萃取用2、澄清濾液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值為3.56.0，加乙酸丁酯分兩次（每次加1020mL）進行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸內上下翻動，使濾液和乙酸丁酯能充分混合接觸，然后靜置30 min使之分層，用100mL燒杯收集上層萃取液3、取上述下相液，加入一定體積的飽和食鹽水，加入乙酸乙酯分兩次萃取，充分混合接觸，待靜置分層后，將上層萃取液（BA液）傾倒出或吸出，轉入另一只燒杯中。4、結晶與干燥：量取乙醇-醋酸鉀溶液，緩慢加入上

8、述BA液中，待有沉淀產(chǎn)生時，攪拌后靜置30min后過濾，得紅霉素晶體，將濕晶體放入燒杯中，加異丙醇3050mL，攪拌成糨糊狀，然后過濾抽提，將濕品平鋪培養(yǎng)皿，可置真空干燥箱干燥得干品。 【注意事項】 1、通過調節(jié)溶液的pH值使紅霉素轉入有機溶劑相或水相，應注意控制溶液的pH值。 2、注意萃取時避免乳化現(xiàn)象。 【結論】 【思考題】 1、常用的萃取溶劑有哪些？ 2、為何選用飽和食鹽水？【評語】【實驗三】 牛血清白蛋白在雙水相萃取系統(tǒng)中的分配 得分：【目的要求】 1、了解雙水相系統(tǒng)成相的原理和方法。 2、掌握雙水相系統(tǒng)分離蛋白質的操作。 【實驗原理】雙水相系統(tǒng)中使用的雙水相是由兩種互不相溶的高分子溶

9、液或者互不相溶的鹽溶液和高分子溶液組成。雙水相系統(tǒng)的制備，一般是將兩種溶質分別配制成一定濃度的水溶液，然后將兩種溶液按照不同的比例混合，靜止一段時間，當兩種溶質的濃度超過某一濃度范圍時，就會產(chǎn)生兩相。 雙縮脲反應是指蛋白質在堿性溶液中與二價銅離子結合，生成紫紅色絡合物的反應。雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，在堿性溶液中與硫酸銅反應生成紫紅色絡合物。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應。蛋白質含有多個肽鍵，因此有雙縮脲反應，其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比?？衫么朔磻獙Φ鞍踪|進行定性鑒別。 【實驗用品】 1、材料牛血清白蛋白 2、試劑PEG6000、硫酸銨、硫酸銅、酒石酸鈉鉀、

10、氫氧化鈉、蒸餾水、雙縮脲試劑其的制備如下：溶解0.15g硫酸銅和0.6g酒石酸鈉鉀于50mL蒸餾水中，在攪拌下加入30mL 10%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到100mL，備用。 3、器具離心機、離心管、燒杯、攪拌棒、量筒、分析天平。 【實驗過程】步驟：實際操作及現(xiàn)象：配制牛血清白蛋白溶液：濃度1 g/L。配制高濃度的聚合物和鹽的母液：PEG6000濃度為400g/L、硫酸銨400 g/L各20mL。按預先設計好的總組成，由母液配制相應的高聚物子液（60g/L、100g/L、140g/L）和鹽的子液（140g/L、140g/L、140g/L）各4mL。將配制好的高聚物和鹽的子液轉移至10mL離心管中

11、，再加入牛血清白蛋白溶液2mL，共三組。離心管封口后，反復倒置510min，每min 610次，使溶液充分混合。在1500r/min下離心35 min后，觀察成相情況。小心地將目標物用吸管吸出，加入雙縮脲試劑進行定性鑒別。 【注意事項】 1、離心前離心管須稱重，離心管重量應保持一致，可用蒸餾水補重，以保證離心機正常運轉。 2、配制雙水相體系時應掌握好聚乙二醇、硫酸銨和水的比例關系。 【結論】 【思考題】 1、雙水相萃取蛋白質的優(yōu)點是什么？ 2、影響雙水相成相的因素有哪些？【評語】【實驗四】 等電點沉析法分離牛乳中的酪蛋白 得分：【目的要求】 1、學習從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。 2、掌握等

12、電點沉析分離的基本操作技術。 【實驗原理】蛋白質、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質，當其溶液在某一pH值時，這些生物大分子的所帶的正負電荷數(shù)目相等而呈電中性，此時溶液的pH值稱為該物質的等電點。生物大分子在其等電點的溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，一般疏水性較強的蛋白質可用此法分離。 【實驗用品】 1、材料鮮牛奶 2、試劑醋酸鈉、優(yōu)級純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液其配制如下：配A液：0.2mol/L醋酸鈉溶液，稱NaAcH2O 5.44g溶至200mL。配B液：0.2mol/L醋酸溶液，稱優(yōu)級純醋酸2.4g溶至200mL。取A液約17.7mL

13、，B液約12.3mL混合，用酸度計調得pH 4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液30mL。 3、器具燒杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、離心機、水浴鍋、布氏漏斗、精密pH試紙或酸度計、表面皿、電子天平、抽濾瓶 【實驗過程】步驟：實際操作及現(xiàn)象：將鮮牛奶30 mL及醋酸-醋酸鈉緩沖液30mL分別水浴加熱40左右。并用8層紗布過濾牛奶。量取加熱后的牛奶20mL。在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20mL。用酸度計調pH至4.7。將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品。用水洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液。在沉淀中加入2

14、0mL乙醇，攪拌片刻。將全部的懸濁液轉移至布氏漏斗中抽濾。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。將沉淀攤開在表面皿上，風干得酪蛋白純品。準確稱量，計算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳測得含量理論含量收率=100%式中理論含量為3.5 g/100mL牛乳 【注意事項】 1、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制應規(guī)范，pH值應用酸度計測試，以準確達到酪蛋白的等電點。 2、加入醋酸-醋酸鈉緩沖液時，動作要緩慢，并慢慢加入，不可操之過急而大量一次加入。 3、離心前溫度一定要降至室溫。 【結論】 【思考題】 1、為何用醋酸-醋酸鈉緩沖液來調酪蛋白的等電點，可否改用酸或堿來？ 2、如何提

15、高酪蛋白的收率？【評語】【實驗五】 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠 得分：【目的要求】 1、乙醇沉析法提取柑橘皮中的果膠的基本原理。 2、掌握有機溶劑沉析法的基本操作技術。 【實驗原理】果膠是植物膠，屬于多糖類，存在于高等植物的葉、莖、根的細胞壁內，與細胞彼此粘合在一起，尤其是果實及葉的含量較多；也是一種親水的植物膠，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有機溶劑，在酸性條件下穩(wěn)定。由于其水溶液在適當?shù)臈l件下可以形成凝膠，具有良好的膠凝化和乳化作用，因此可用于制造果醬、果凍或膠狀食物，也可用作食品添加劑、微生物培養(yǎng)基及保護劑等。果膠因其酯化度不同，可分為高酯果膠和低酯果膠。采用的原料和提

16、取方法不同可得到不同酯化度的果膠。以柑橘皮為原料生產(chǎn)的為高酯果膠（向日葵果膠其酯化度為30，是低酯果膠）。柑橘皮中果膠含量很高，一般為515左右。大部分以果膠質形式存在，果膠質不溶于水，但用稀酸可將其水解為可溶性果膠，利用多糖類物質在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果膠從溶液中析出，經(jīng)分離、干燥即得果膠純品。 【實驗用品】 1、材料 新鮮柑橘皮50g 2、試劑正磷酸、O.2molL鹽酸、焦磷酸鈉（又稱磷酸四鈉）、80乙醇、95乙醇、硅藻土粉末。 3、器具組織搗碎機、大燒杯（500mL）、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、搪瓷桶、酸度計、不銹鋼鍋、板框壓濾機。 【實驗過程】步驟實際操作

17、及現(xiàn)象1、預處理：將柑橘皮在組織搗碎機中搗碎置于不銹鋼鍋中，加入45倍的清水攪拌，加熱到5060浸泡10min，加熱至沸水中浸5min8min，以達到滅酶目的。滅酶后的柑橘皮在不斷攪動下用流動水沖洗至洗液接近無色為止。2、提取：取處理好的柑橘皮置于搪瓷桶中，加入15倍量的自來水，再加入水量0.5的焦磷酸鈉。在不斷攪拌的條件下，用鹽酸和0.5磷酸的混合酸調節(jié)提取液的pH值，溫度控制在7582，調節(jié)提取液pH值至1.52.0時繼續(xù)攪拌提取20min，然后再調節(jié)pH值至2.5，繼續(xù)再提取20min。3、分離：將提取液加入1的硅藻土作助濾劑，然后送入板框壓濾機。過濾后得無色透明的果膠稀溶液，濾渣棄去。

18、4、濃縮：將過濾收集的濾液置于真空濃縮裝置中，于75溫度下濃縮，直至濃縮到果膠濃度為4左右。5、沉析：將濃縮液置于搪瓷桶中，并冷至室溫，然后乙醇以噴淋方式加至已濃縮好的果膠溶液中，乙醇含量控制在4050的范圍內，不斷攪動。這時，果膠聚結成海綿狀析出。6、分離：將果膠乙醇混合物經(jīng)12h靜置后，送入板框壓濾機過濾。收集濾餅(果膠)，然后用80乙醇溶液洗滌濾餅12次，再用95的乙醇洗滌12次。洗完后壓干。7、干燥：將以上濾好的果膠置于真空干燥器中于55左右干燥，即得果膠純品。 【注意事項】 1、提取溫度 溫度過高容易引起果膠解聚，降低果膠膠凝能力。溫度過低，則會延長萃取時間，造成果膠過分脫脂，一般以

19、7582為宜。 2、提取時間 時間短，提取不完全；時間過長，則會引起果膠降解，難以得到高質量的果膠。提取時間以40min60min為宜。 3、提取的pH值 pH值高，獲得果膠的膠凝能力強，但果膠收率低，當pH值大于3.5時，就很難得到果膠。pH值低，果膠收率提高，但質量下降。在提取過程中，體系的pH值會發(fā)生變化，要經(jīng)常用試紙檢測溶液的pH值，要使之保持穩(wěn)定，以保證提取正常進行。 4、脫色及醇洗 滅酶后的柑橘皮水洗脫色及進行分離操作時助濾劑的使用都有一定的脫色作用。脫色處理要徹底及最后的高濃度乙醇洗滌果膠濾餅時要充分，否則影響所得果膠純品色澤及含量。 【結論】 【思考題】 1、柑橘皮預處理時為何

20、要加熱至沸而滅酶？ 2、如何提高果膠的收率和質量？ 3、提取時加入焦磷酸鈉的作用？【評語】【實驗六】 透析法脫鹽 得分：【目的要求】 1、學習透析的原理 2、掌握透析技術的操作。 【實驗原理】透析是利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽、單糖等分開。常用的半透膜是玻璃紙或稱塞璐玢紙、火棉紙或稱塞璐錠紙和其他改型的纖維素材料。透析時把待純化的蛋白質溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內無機鹽等小分子物質降低到最小值為止。 【實驗用品】 1、材料蛋白質的氯化鈉溶液：三個除去卵黃的雞蛋清與700mL水及300mL飽和

21、NaCl溶液混合后，用數(shù)層紗布過濾。 2、試劑10%硝酸溶液、1%硝酸銀溶液、10%氫氧化鈉溶液、1%硫酸銅溶液。 3、器具透析管或玻璃紙、燒杯、玻璃棒、電磁攪拌器、試管及試管架。 【實驗過程】步驟實際操作及現(xiàn)象1、卵清蛋白溶液加10%CuSO4和10%NaOH，進行雙縮脲反應。2、在透析管（或玻璃紙裝入蛋白質的氯化鈉溶液后扎成袋形，系于一橫放在燒杯中的玻璃棒上）中裝入1015mL蛋白質的氯化鈉溶液并放在盛有蒸餾水的燒杯中。3、1h后，自燒杯中取水12mL，加10%HNO3溶液數(shù)滴使成酸性，再加入1%AgNO312滴，檢驗氯離子的存在。4、從燒杯中取水12mL水，進行雙縮脲反應，檢驗是否有蛋白

22、質的存在。5、不斷更換燒杯中的蒸餾水（并用電磁攪拌器不斷攪動蒸餾水），加速透析過程。6、數(shù)小時后，從燒杯中的水中不再能檢出氯離子。此時停止透析并檢查透析袋內容物是否有蛋白質或氯離子存在（此次應觀察到透析袋中球蛋白沉淀的出現(xiàn)，這是因為球蛋白不溶于純水的緣故）。 【注意事項】 1、透析袋使用前應檢查是否破裂并進行預處理。 2、將樣品放入透析袋內，兩端要封閉（注意袋內不要留氣泡）。 3、透析過程中，注意更換透析袋外水的次數(shù)，加快透析速度和效率。 【結論】 【思考題】 1、如何檢查透析袋內容物是否有蛋白質或氯離子存在？ 2、檢驗氯離子的存在時為什么要加10%HNO3數(shù)滴? 3、常用的半透膜材質有哪些?

23、 【評語】【實驗七】 硫酸銨分級鹽析分離血清中的主要蛋白質 得分：【目的要求】 1、了解鹽析法分離血清中的主要蛋白質的基本原理； 2、掌握硫酸銨分級鹽析的基本操作技術。 【實驗原理】鹽析是最常用分離蛋白質的方法，是利用各種蛋白質所帶電荷不同、相對分子質量不同，從而在高濃度的鹽溶液中溶解度就不同，因此一個含有幾種蛋白質的混合液，就可用不同濃度的中性鹽來使其中各種蛋白質先后分別沉析下來，達到分離純化的目的，這種方法稱為分級鹽析。一般粗提取物常用它進行粗分離。常用的鹽析劑有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鈉等，其中最常用的是硫酸銨。用鹽析法分離蛋白質，簡便安全，而且所得的蛋白質并不喪失活性，

24、是分離純化中最佳的一種方法。在實際操作時，可先把蛋白質溶液調至等電點，使其溶解度達到最低，然后加入粉末固體硫酸銨或飽和硫酸銨溶液，并達到一定濃度。這時蛋白質即從溶液中析出，經(jīng)過濾或離心，透析去鹽，即可獲得產(chǎn)品。 【實驗用品】 1、材料新鮮動物血漿或血清（無溶血現(xiàn)象）：100mL 2、試劑pH7.2飽和硫酸銨溶液、0.2mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）其配制方法如下：（1）配A液 0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液(稱取磷酸氫二鈉5.37g加去離子水精確配100mL)；（2）配B液 0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液(先稱取磷酸二氫鈉3.12g加去離子水精確配100mL)；（3） 取A液約

25、72mL，取B液約28mL，然后將這兩種溶液邊混合邊用高精度pH試紙檢測，調配成約100mL濃度為0.2mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖溶液備用。 3、器具離心機、大燒杯（500mL）、燒杯（250mL）、高精度pH試紙、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。 【實驗過程】 1、清蛋白與球蛋白分離步驟實際操作及現(xiàn)象取100mL血漿或血清置于500mL燒杯中，加PBS 100mL攪拌10min。在攪拌下慢慢滴加200mL pH7.2飽和硫酸銨溶液。加完飽和硫酸銨溶液后繼續(xù)攪拌2030min以充分沉淀球蛋白。離心（3500r/min）20min，棄去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各種球蛋白。 2、各種

26、球蛋白的分離步驟實際操作及現(xiàn)象用100mL PBS溶解上述沉淀中的各種球蛋白，并轉移至250mL燒杯中攪拌15min。在攪拌下，慢慢滴加25mL飽和硫酸銨溶液，飽和度達20%。離心（3500r/min）20min，沉淀含少量纖維蛋白質，取上清液。上清液在攪拌下，慢慢滴加18mL25mL飽和硫酸銨溶液，飽和度達30%33%。離心（3500r/min）20min得上清液和沉淀（主要含-球蛋白和少量-球蛋白）。?。?）中沉淀溶于PBS中使體積達100mL并轉移至250mL燒杯中攪拌15min。在攪拌下，慢慢滴加43mL50mL飽和硫酸銨溶液，約達30%33%飽和度。離心（3500r/min）20mi

27、n得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）。?。?）中上清液在攪拌下，慢慢滴加35mL40mL飽和硫酸銨溶液，飽和度約達45%。離心（3500r/min）20min得上清液（主要為-球蛋白）和沉淀（主要為-球蛋白）。 【注意事項】 1、緩沖液的配制應準確。 2、滴加飽和硫酸銨溶液的速度要慢一些及攪拌的速度應適中。 3、加完硫酸銨溶液后要靜置一段時間，至少20 min30 min，使沉淀完全。 【結論】 【思考題】 1、本實驗屬于蛋白質分級鹽析技術的Ks法還是法？ 2、如何繼續(xù)分離純化上清液中球蛋白? 3、為何加磷酸鹽緩沖液？ 【評語】【實驗八】 活性炭吸附分離色素實驗 得分：【目的要求】

28、 1、了解吸附基本原理； 2、掌握活性炭和木炭簡單的靜態(tài)及動態(tài)吸附的基本操作。 【實驗原理】活性炭具有較大的比表面，在水溶液中比一般固態(tài)物質吸附能力強得多，故可以吸附許多物質的分子及離子。本實驗用活性炭、木炭靜態(tài)和動態(tài)吸附溶液中的色素及氣體。 【實驗用品】 1、材料紅心蘿卜(或胡蘿卜)8kg、活性炭粉(或木炭粉) 8kg、脫脂棉1包 2、試劑石蕊試劑500mL；濃硝酸500 mL；銅屑400g；高錳酸鉀400g 3、器具組織搗碎機、大燒杯、小燒杯、U形管、漏斗、直通管、導管、漏斗架、濾紙、玻璃棒錐形瓶、膠塞、導管、玻璃管、橡皮圈、小試管等 【實驗過程】步驟實際操作及現(xiàn)象1、活性炭靜態(tài)吸附石蕊

29、將石蕊稀釋液放在小燒杯中，加活性炭粉兩匙然后攪拌片刻，放入過濾器中過濾，用另一燒杯或試管收集液體，觀察濾液顏色。2、活性炭動態(tài)吸附胡蘿卜色素 選深紅色，質地緊密，色素含量高的紅心胡蘿卜切碎打漿，過濾得含胡蘿卜色素的溶液。然后以直通管中段全部用活性炭裝滿，兩端堵上紗布棉團，上面單孔塞裝上漏斗，下面單孔塞加一個短導管作為濾液出口，實驗前將這套裝置固定于鐵架臺上，把含有蘿卜色素的溶液放入漏斗中，觀察下面接受器中收集到的溶液顏色。3、木炭吸附高錳酸鉀 U形管中放入約1/3容積的小塊木炭，兩管口同時加脫脂棉一團，實驗時從左管口加入稀高錳酸鉀溶液。不久右管上層液面漸漸升高，觀察右管上層液面顏色。4、制二氧

30、化氮氣體 取兩只帶塞錐形瓶、以細線拴牢一只小試管，小試管中有一兩片銅屑，滴加濃硝酸后立即吊入錐形瓶中，待瓶中氣體的棕紅色明顯時即將小試管轉移到另一錐形瓶中，同時給第一只瓶加塞，第二瓶也同樣濃度后，取出加塞，并立即把小試管連同內中廢液一起浸入大水杯中，此廢液若量少可棄去，但可以把洗凈的銅屑晾干回收。5、活性炭吸附氣體 將兩匙處理過的木炭粉或活性炭粉倒入瓶中并立即加塞塞緊搖動錐形瓶、搖瓶時力求瓶上部在轉動的中軸處，只讓炭粉在瓶底部轉動，觀察到瓶內二氧化氮的顏色變化。 【注意事項】 1、所用木炭或活性炭一定要處理過，增強了它的吸附活性，實驗前應將木炭或活性炭放在坩堝里烘烤，充分進行解吸。 2、選用有

31、色液體顏色不可太濃，否則吸附不凈可能會出現(xiàn)濾液帶色，得不到無色清液。 3、榨取的胡蘿卜汁在活性炭脫色前，應進行過濾前處理，避免汁液過粘影響活性炭吸附效果。 4、所用錐形瓶在實驗前應當是完全干燥的。 【結論】 【思考題】 1、實驗中操作第1步和第2步用同樣的胡蘿卜色素和活性炭，哪步吸附效果顯著？ 2、木炭、活性炭哪種吸附劑的吸附效果好？【評語】【實驗九】 甘露醇的制備及鑒定 得分：【目的要求】 1、了解甘露醇的理化性質； 2、掌握從海帶中分離提純甘露醇的原理和基本操作技術。 【實驗原理】甘露醇（別名：己六醇）為白色針狀或斜方柱狀晶體或結晶性粉末，無臭，略有甜味，不潮解。易溶于水，溶于熱乙醇，微溶

32、于低級醇類和低級胺類，微溶于吡啶，不溶于有機溶劑，具有多元醇的化學性質，可以被酯化、醚化、氧化、脫水。在無菌溶液中較穩(wěn)定，不易被空氣所氧化，熔點165168。甘露醇在海藻、海帶中含量較高。海藻洗滌液和海帶洗滌液中甘露醇的含量分別為2與1.5，是提取甘露醇的重要資源。本實驗以海帶為原料，用自來水浸泡提取甘露醇；通過調節(jié)酸度，沉淀除雜質；煮沸濃縮后用乙醇沉淀甘露醇；最后通過回流、重結晶、活性炭脫色等工藝精制甘露醇。 【實驗用品】 提取液濃縮回流提取粗品精制海藻制備甘露醇的操作流程海藻浸泡提取堿化、酸化1、材料海藻或海帶、粉末活性炭 2、試劑30NaOH、硫酸-水混合液(1：1)、95乙醇、1mol

33、L三氯化鐵溶液、1molLNaOH溶液 3、器具電瓷爐、不銹鋼鍋、布式漏斗、抽濾瓶回流裝置、pH試紙 【實驗過程】 （一）操作流程 （二）操作要點步驟實際操作及現(xiàn)象1、浸泡提取 將海藻或海帶加20倍量自來水，室溫浸泡23h，用手搓洗將藻體或海帶上的甘露醇洗入水中，收集的浸泡液用作第二批原料的提取溶液，一般浸泡4批后浸泡液中的甘露醇含量已較大。2、堿化、酸化 將浸泡液倒入不銹鋼鍋中，邊攪拌邊用30NaOH調pH1011，靜置6h，凝集沉淀多糖類黏性物，待黏性物充分凝聚沉淀后，虹吸上清液，用1：1H2S04-H20中和至pH67，過濾進一步除去膠狀物，得中性提取液。3、濃縮 將中性提取液倒入不銹鋼

34、鍋中，加熱至沸騰蒸發(fā)，溫度110150，大量氯化鈉沉淀，不斷將鹽類與膠狀物撈出，直至呈濃縮液，取小樣倒于玻璃板上，稍冷卻應凝固。將濃縮液冷卻至6070趁熱加入2倍量95乙醇，不斷攪拌，漸漸冷卻至室溫后，離心甩干除去膠質，得灰白色松散物。4、回流提取 取松散物，加入8倍量的95乙醇加熱回流30min，冷卻過濾，離心（2500rmin）15 min，得白色松散甘露醇粗品，同上操作，乙醇重結晶1次。5、精制 甘露醇粗品加適量蒸餾水，加熱溶解，再按6質量加入粉末活性炭，不斷攪拌，加熱至沸騰，趁熱（80）過濾(或壓濾)，少許水洗活性炭2次，合并洗濾液(如有渾濁重新過濾)，高溫濃縮至濃縮液相對密度為1.2

35、左右時，在攪拌下冷卻至室溫，低溫結晶，抽濾至干，得到結晶甘露醇，烘干（105110）得甘露醇純品。6、鑒別 取所制得的甘露醇純品飽和溶液1mL，加1molL三氯化鐵溶液與1molLNaOH溶液各O.5mL，即生成棕黃色沉淀，振搖不消失，滴加過量的1molL NaOH溶液，即溶解成棕色溶液。符合此現(xiàn)象，可初步斷定為甘露醇。 【注意事項】 1、精制時濃縮液相對密度對結晶效果有影響，應掌握好，可測量。 2、濃縮時撈出膠狀物容易，但撈出鹽類稍難，可采用多次傾倒或過濾等方法。 【結論】 【思考題】 1、本次實驗中所得甘露醇的收率是多少？ 2、如何提高甘露醇的收率？【評語】【實驗十】 胡蘿卜素的柱層析分離

36、 得分：【目的要求】 1、了解柱層析的基本原理 2、掌握胡蘿卜素分離的操作方法 【實驗原理】本實驗采用氧化鋁為固定相的吸附層析。各種物質具有不同的吸附力，幾種吸附力不同的物質流經(jīng)層析柱時，被吸附劑吸附的程度和在溶劑中的溶解度存在差異，因此解吸作用的程度也不相同。因此解吸作用的程度也不相同。由于流動相的洗脫作用，使吸附解吸過程反復進行，吸附力弱、易溶于洗脫劑的物質首先流動，次弱的物質續(xù)后移動，從而使混合的幾種物質彼此分開。胡蘿卜素存在于胡蘿卜、辣椒等黃綠色植物中，由于在動物體內可將胡蘿卜素轉變?yōu)榫S生素A，故又稱維生素A原。胡蘿卜素（屬多烯色素類，又可分為、等幾種類型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有機

37、溶劑從食物中提取出來，并能被氧化鋁所吸附。由于胡蘿卜素與其他植物色素的化學結構不同，它們在有機溶劑中的溶解度以及被氧化鋁吸附的強度也不相同，故將抽提液進行氧化鋁柱層析，再用石油醚等沖洗層析柱，即可將植物提取液中混合的胡蘿卜素分離成不同的色帶。同植物其他色素相比較，胡蘿卜素的極性最小，吸附最差，用石油醚洗脫速度最快，故被最先洗脫下來，使胡蘿卜素與其他色素分開。同時也可將胡蘿卜素層析帶洗脫下來進行比色定量。 【實驗用品】 1、材料新鮮紅辣椒、氧化鋁（Al2O3，高溫烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、試劑95%乙醇、無水硫酸鈉、石油醚（沸點6090）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；體積比

38、）、三氯化銻氯仿溶液（稱取三氯化銻22g，加100mL氯仿溶解后，貯于棕色瓶中）。 3、器具剪刀、研缽，層析柱（1cm16cm）,100mL分液漏斗，量筒100mL，鐵架臺及蝶形夾，蒸發(fā)皿，恒溫水浴，天平，燒杯、軟木塞、棉花、膠頭滴管、濾紙、試管 【實驗過程】步驟實際操作及現(xiàn)象1、提?。悍Q取新鮮去籽紅辣椒12g（或去籽干紅辣椒23g），剪碎后放入研缽中，加入4毫升95%乙醇，研磨，此勻漿液呈深紅色，再加入6mL石油醚，繼續(xù)研磨3至5min，勻漿提取液顏色的深淺與胡蘿卜素的含量成正比。將勻漿提取液倒入100mL分液漏斗中，用20mL蒸餾水洗滌勻漿液數(shù)次，直至水層透明為止，借此除去提取液中的乙醇。

39、將紅色石油醚提取液層倒入干燥試管中，加少量無水硫酸鈉除去水分，用軟木塞塞緊，以免石油醚揮發(fā)。2、制備層析柱：取直徑為1cm、高度約16cm的玻璃層析柱，在柱的最底部放入少量棉花，將石油醚氧化鋁懸液（石油醚：Al2O3=1:1,體積比），邊攪邊倒入層析柱，使氧化鋁均勻沉積于柱內，高度約10cm即可，在其上部鋪一張圓形小濾紙，并將層析柱垂直固定在鐵架臺上，柱下方加一調控閥，備用。3、層析：打開層析柱下端調控閥，加石油醚讓其緩慢流下，當石油醚浸入到與氧化鋁表面相平時，即用吸管吸取胡蘿卜素石油醚提取液1mL，沿管壁加入到層析柱上端。待提取液全部進入層析柱時，立即用1%丙酮-石油醚液洗脫液沖洗，此時應控

40、制流量在每min30滴左右，使吸附在柱上端的物質逐漸展開成為顏色不同的數(shù)條色帶。仔細觀察色帶的位置、寬度與顏色的深淺。自下而上的橘黃色帶分別為胡蘿卜素，胡蘿卜素、胡蘿卜素（通常含量分別為15%、85%、0.1%）。4、鑒定：接收此橘黃色液體于蒸發(fā)皿內，在80水浴上使石油醚、丙酮揮發(fā)，滴入三氯化銻氯仿溶液數(shù)滴，可見藍色反應，借此鑒定胡蘿卜素。（同時，也可直接將洗脫下來的液體蒸干后，用石油醚溶解殘渣于5mL帶塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶解，用1cm比色杯，在450nm波長處，以石油醚做空白液調零點，讀取石油醚溶解液及標準液的光密度值，計算胡蘿卜素含量）。 【注意事項】 1、實驗中一定要將新

41、鮮紅辣椒研細，以徹底破壞植物細胞，使胡蘿卜素釋放更完全。丙酮可增強分離效果，有利于對胡蘿卜素的提取，若分離條件控制得好，可依次提取、分離得到胡蘿卜素，胡蘿卜素、胡蘿卜素，以及緊隨其后的是辣椒紅素，番茄紅素及葉黃素等植物色素。 2、為使分離色帶整齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡，氧化鋁的高度一般為玻璃柱高度的3/4，裝好柱后柱上面覆一層濾紙，以保持柱上端頂部平整，若上端不平，影響分離效果而產(chǎn)生不規(guī)則的條帶。 3、分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個操作中絕不能使氧化鋁表面的液體流干。吸附柱層析方法最適合非極性與極性不強的有機物（如胡蘿卜素、甘油酯、磷脂、膽固醇等物

42、質）的分離。 4、三氯化銻腐蝕性較強，在實驗過程中切勿觸及皮膚。三氯化銻遇水生成堿式鹽，再轉變成氯氧化銻，此化合物與胡蘿卜素不發(fā)生顏色反應，而出現(xiàn)渾濁。 5、石油醚提取液中的乙醇必須洗凈，否則吸附不好，層析中色帶也彌散不清。 6、層析柱底部棉花的用量不宜過多，松緊要適宜，否則將影響流速。 【結論】 【思考題】 1、吸附層析法的基本原理是什么？ 2、簡述植物色素的極性大小與洗脫速度的關系?！驹u語】【實驗十一】離子交換色譜分離混合氨基酸 得分：【目的要求】學習用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和原理。 【實驗原理】有些高分子物質含有一些可以解離的基團，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應。這類高

43、分子物質統(tǒng)稱離子交換劑，其中使用的最普遍的是離子交換樹脂。由于一定離子交換劑對于不同離子的靜電引力不同，因此在洗脫過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后完全分離。本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量為133.1）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI=9.74，分子量為146.2）的混合液。在pH=5.3條件下，因為pH值低于Lys的pI值，Lys可解離成陽離子結合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH=12條件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的pH值

44、可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。 【實驗用品】 1、材料磺酸型陽離子交換樹脂（732型） 2、試劑樹脂處理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH緩沖液（pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。 3、器具離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、恒流泵。 【實驗過程】步驟實際操作及現(xiàn)象1、新樹脂的處理和轉型干樹脂用蒸餾水充分浸泡膨脹后，傾去細小顆粒，然后用4倍體積的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗攪拌30min，并分別用蒸餾水洗至中性

45、（最后應處理至溶液無黃色）。再用1mol/L NaOH浸泡510 min，使樹脂轉為鈉型。以蒸餾水洗去NaOH至樹脂pH呈中性（大約洗23次）。2、裝柱前準備：用蒸餾水沖洗層析柱，將層析柱垂直裝好，在柱流水出口處裝上乳膠管，關閉柱底出口（或使用調控閥），在柱內加入23cm高的檸檬酸緩沖液，排出乳膠管內氣泡，抬高乳膠管出口，防止柱內緩沖液排空。3、裝柱：將處理好的樹脂放入燒杯中，加入1倍2倍體積的檸檬酸緩沖液并攪拌成懸浮狀，沿柱內壁緩慢流入裝柱，待樹脂自然下沉在柱底部逐漸沉積23cm高時，慢慢打開柱底出口，再繼續(xù)加入樹脂懸液直至樹脂沉積高度為1618cm時為止。裝柱要求連續(xù)、均勻，無分層、無氣泡

46、等現(xiàn)象產(chǎn)生，必須防止液面低于樹脂平面，否則要重新裝柱。4、平衡：層析柱裝好后，再緩慢沿管壁加滿檸檬酸緩沖液，接上恒流泵，用檸檬酸緩沖液以5滴/min流速平衡40min左右，直至用pH試紙測得流出液的pH與緩沖液的pH相等為止。5、加樣與洗脫：移去層析柱上連接泵的橡膠管，打開柱底出口，小心使柱內緩沖液的液面與樹脂平面幾乎相平時即行關閉（注意：不要是樹脂露出液面）。馬上用加樣器吸取氨基酸混合樣品0.5mL，沿靠近樹脂表面的管壁慢慢加入（注意不要破壞樹脂平面），然后緩慢打開柱底管夾，使液面再與樹脂面相齊時關閉。然后加少量檸檬酸緩沖液清洗內壁23次，使樣品進入柱內。當樣品完全進入樹脂床內，即可接上恒流

47、泵，調流速0.5mL/min，開始洗脫。6、收集：柱洗脫液可用自動分部收集器或以刻度試管人工收集，按每管3mL先收集5管。7、改用pH=12 NaOH緩沖液洗脫收集：關閉恒流泵和柱底夾，將洗脫液更換為pH=12 NaOH緩沖液，然后按上面同樣方法繼續(xù)收集第6管到第10管。8、測定：將收集的洗脫液各管編好號后，分別取0.5mL收集于一潔凈的試管中，加入檸檬酸緩沖液（pH=5.3）1mL，茚三酮顯色液0.5mL，混合后置沸水水浴加熱15min，取出，用冷水冷卻。 【注意事項】 1、為使分離色帶整齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡。 2、分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在

48、整個操作中絕不能使樹脂表面的液體流干。 3、一直保持流速10滴/min12滴/ min，并注意勿使樹脂表面干燥。 【結論】 【思考題】 1、離子交換樹脂用緩沖液平衡，為什么又用緩沖液沖洗？ 2、何謂氨基酸的離子交換？本實驗采用的離子交換劑屬于哪一種？ 【評語】【實驗十二】凝膠柱層析分離蛋白質 得分：【目的要求】 1、熟悉凝膠層析分離的基本原理； 2、掌握凝膠柱層析填充物的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術。 【實驗原理】凝膠層析是利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進行分離的技術。當溶液在層析柱內流過時，各種物質分子在柱內同時進行向下的移動和不定向的分子擴散運動。大分子物質由于分子直徑大，難于進入凝膠顆粒的微孔，只能在凝膠顆粒的間隙中隨流動相快速向下移動；而小分子物質能夠擴散進入凝膠顆粒的微孔中，因此在流動過程中不斷地進出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質向下移動的速度落后于大分子物質，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小的順序先后流出層析柱，達到分離純化的目的。 【實驗用品】 1、材料葡聚糖凝膠Sephadex G-50、藍色葡聚糖2000、牛血清蛋白 2、試劑（1）藍色葡聚糖-2000（2mg/mL）和牛血清蛋白（6mg/m