實時熒光定量PCR技術(shù)的研究報告進展及應(yīng)用

1、-. z.實時熒光定量PCR技術(shù)的研究進展及應(yīng)用摘要:實時熒光定量PCR技術(shù)通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光訊號強度來到達定量的目的,該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已在動植物基因工程,微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。本文對實時熒光定量PCR技術(shù)的原理，檢測方法的原理、優(yōu)缺點進展了評述,重點及創(chuàng)新點是對實時熒光定量PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，食品行業(yè)，植物方面的應(yīng)用進展了比擬全面的綜述,并對實時熒光定量PCR技術(shù)的普及應(yīng)用及領(lǐng)域的前景做了進一步的展望。關(guān)鍵詞：實時熒光定量PCR；應(yīng)用；展望Research pr

2、ogress and application of real-time PCR technologyAbstract: Real-time PCR technology to detect PCR product by fluorescence quantitative signal strength to achieve the purpose , the technology not only to achieve the PCR from qualitative to quantitative leap , and pared with conventional PCR, it is m

3、ore specific , effective solution to PCR contamination problem , degree of automation , has been widely used in genetic engineering of plants and animals , microbes and medicine fields . In this paper, the principle of real-time PCR technology, principles , testing methods, advantages and disadvanta

4、ges are reviewed , the focus and innovation is a real-time PCR technology in the field of medicine , food industry, plant aspects of the application of a more prehensive overview , prospects and real-time PCR technology in the field of universal application and made a further outlook .Keywords: Real

5、-time quantitative PCR; application ; Outlook聚合酶鏈反響(PCR)技術(shù)自1985年問世以來，以其靈敏性高、特異性強和速度快在分子生物學(xué)等科研領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準確定量，在操作過程中易受污染而使假陽性率偏高；因此，使其應(yīng)用受到限制。實時熒光定量PCR技術(shù)擁有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反響等優(yōu)點，已成為了分子生物學(xué)研究的重要工具。文章對實時熒光定量PCR技術(shù)的原理、檢測方法、定量方法及其應(yīng)用進展了綜述。1.實時熒光定量PCR技術(shù)概述1.1實時熒光定量PCR技術(shù)的原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，

6、是指在PCR反響體系中參加熒光基團，利用熒光積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進展定量分析的方法1。實時熒光定量PCR是在反響體系中參加熒光基團，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴增曲線如圖1。在PCR反響早期,不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別,之后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期,因此可以在指數(shù)期的*一點上檢測PCR產(chǎn)物的量,并由此推斷起始模板含量。為了準確判斷樣品中*基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR采用參數(shù)Ct值，Ct值也稱閾值循環(huán)(threshold cycle),指PCR循環(huán)過程中,熒光信號開場由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對

7、應(yīng)的循環(huán)次數(shù),也就是每個反響管的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究結(jié)果說明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小2。利用起始拷貝數(shù)的標準樣品可作出標準曲線,因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)3。圖1 實時熒光定量PCR的標準擴算曲線1.2實時熒光定量PCR技術(shù)的檢測方法實時熒光技術(shù)PCR是在擴增產(chǎn)物聚集的過程中連續(xù)檢測,即實時檢測,根據(jù)在指數(shù)擴增期的產(chǎn)物量來推算初始模板的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR包括探針類和染料類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加。染料類如SYBRGreen

8、 I則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟特異性更高；但后者則簡便易行、本錢較低。熒光標記探針按其基團標記和能量轉(zhuǎn)移的方式,目前已經(jīng)開發(fā)出幾種相關(guān)的技術(shù),大體可以分為水解探針和雜交探針兩類。如Taq ManTM探針(水解探針)、Taqman MGB (水解探針) (Dual-oligo FRET pairs(雙雜交探針)、Molecular beacons (雜交探針)、Universal probe library LNA ( locked nucleic acids (水解探針)、Simple proble探針等4。1TaqMan探針 該

9、探針是長度為2024b的寡核苷酸，在其5末端標記1個熒光報告基團，3末端標記1個熒光淬滅基團，其序列與2個引物包含序列的1段DNA模板完全互補。該方法是當探針保持完整時利用Taq酶(53外切酶)的活性淬滅基團吸收發(fā)射的熒光。當有特異的PCR發(fā)生時，Taq酶發(fā)揮其53外切酶活性，將與模板雜交的探針切碎，報告基團與淬滅基團別離，淬滅作用被解除，熒光信號釋放，通過檢測系統(tǒng)就可以觀察到信號的變化，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成呈正相關(guān)。每擴增1條DNA鏈，就有1個游離的熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。利用標準模板系列繪制出標準曲線，結(jié)合各樣品的Ct值，可以確定樣品的起初模

10、板量5。由于探針與目標片段之間的特異雜交產(chǎn)生熒光信號，因而此方法可通過探針增強檢測的特異性，且能夠提供多重檢測功能。2TaqmanMGBTaqmanMGB探針是Taqman探針的根底上改良的,在探針的3端增加了MGB (minor groove binder)分子,這種物質(zhì)能夠結(jié)合在雙鏈DNA小溝部位；MGB提高了探針的TM值,從而使它能夠分辨1個堿基的差異:完全配對,有熒光信號；一個堿基不匹配,則沒有信號；而且連在MGB分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團,因此這種探針具備更好的淬滅效果且無背景熒光、熒光標記靈活、提高熒光信號的信噪比、提高退火溫度、探針短、提高SNP識別率等優(yōu)點。從而具備了更加廣

11、泛的應(yīng)用前景。3分子信標分子信標是一種呈發(fā)夾構(gòu)造的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，環(huán)部大小為1535bp，能與靶DNA序列互補，莖部由GC含量較高的與靶DNA無序列同源性的互補序列構(gòu)成，探針的5端與3端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團。當分子信標處于自由狀態(tài)時，發(fā)夾構(gòu)造的2個末端靠近，使熒光報告基團與淬滅熒光基團靠近，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)，熒光信號被淬滅；因此，檢測不到熒光信號6。當有靶序列存在時，分子信標與靶序列結(jié)合，使分子信標的發(fā)夾構(gòu)造翻開呈線型，熒光報告基團與淬滅基團彼此在空間上產(chǎn)生足夠的距離，此時熒光報告基團不能被淬滅，熒光檢測儀器可檢測到熒光。隨著每次擴增產(chǎn)物的積累，熒光強

12、度增加，可反映出每次擴增末擴增產(chǎn)物積累的量。分子信標法的特點是探針可循環(huán)利用，適用于檢測點突變，特異性更明顯。但探針標記較復(fù)雜，并且要求其游離在溶液中時探針能無選擇性折疊，當莖構(gòu)造的熱力學(xué)溫度過高時還會影響探針與靶序列雜交。4雙雜交探針雙雜交探針技術(shù)是Roche公司開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)，使用2個雜交探針，能提高特異性。該技術(shù)是將2條探針中的1條在5端標記熒光，1條在3端標記熒光，其中一個為受體熒光基團，另一個為供體熒光基團，2個探針可與模板同1條鏈相鄰的序列雜交。在自由狀態(tài)時，供體熒光基團的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團的激發(fā)光譜；因此，只能檢測到供體熒光基團發(fā)出的熒光。在PCR退火階段中2條探

13、針與目的基因特異性結(jié)合，首尾連接，使供體和受體熒光距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使受體熒光基團發(fā)出熒光。由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，而非累積信號。該方法的特點是淬滅效率高，但由于2個探針結(jié)合于模板上；因此，會影響擴增效率，而且需要合成2個較長的探針，合成本錢相對較高。5Universal probe library-LNA (locked nucleicAcids)新近Roche公司研發(fā)并建立了人類和鼠的通用探針庫,其探針是由鎖定核酸組成。他們通過分析人的轉(zhuǎn)錄組中所有不同的可能的8至9堿基序列,按照他們在轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率分類,找出最普便的8至9堿基序

14、列模式制備成通用探針;每一個探針可以與7000個轉(zhuǎn)錄子雜交。這種探針的特異性由探針和引物共同實現(xiàn)。LNA是一種雙RNA聚合的類似物,其2p-位的氧原子與核糖4p-碳原子形成亞甲基的橋鍵,并分別在5p和3p標記上熒光報告基團和淬滅基團；LNA單體摻入寡核苷序列可以增加形成體的Tm值,其穩(wěn)定性比PNA高(PNAS2000, 97: 5633-5638)1因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性,故這種探針穩(wěn)定性最好；而且探針實現(xiàn)了設(shè)計迅速簡單、低本錢的水解探針特點。一般上其公司后,輸入基因序列號,就能訂制,無需檢測引物二聚體和非特異性片段。因此LNA

15、技術(shù)實現(xiàn)了高熔點和高特異性結(jié)合特點；可以用于所有的熒光定量PCR儀。6Simple探針最近Roche公司生產(chǎn)一種簡單探針,這種探針只在5端標有報告熒光,在報告熒光和5端之間連接一種稱作linker的構(gòu)造,只有在變性階段,探針與目標序列互補結(jié)合時,引起linker構(gòu)造發(fā)生改變,從而報告熒光基團的熒光得以顯現(xiàn)。這種探針的好處是不用淬滅基團,從而無背景熒光。1.2.2 雙鏈DNAdsDNA)結(jié)合染料目前用于實時PCR的dsDNA結(jié)合染料,主要有SYBRGreenI和LC Green TMI7。1SYBRGreen I是一種非飽和菁類熒光素,可以嵌合于DNA雙鏈構(gòu)造的小溝中。其處于游離狀態(tài)時,檢測不到

16、熒光信號,當結(jié)合dsDNA后熒光強度明顯增強,即被熒光探測系統(tǒng)檢測到,熒光強度的增加與初始模板量相關(guān),可以進展定量DNA分析,已有應(yīng)用于臨床診斷和科學(xué)研究中的報道。SYBR Green染料法與探針法相比,其優(yōu)勢在于檢測方法簡便,同時降低了檢測本錢。但是,由于該染料能夠結(jié)合任何dsDNA分子,因此不能保證PCR的特異性?？梢酝ㄟ^優(yōu)化PCR的反響條件,減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生,另外,也可以借助融解曲線分析法來區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進展定性診斷。2LC Green TMI是最新出現(xiàn)的一種dsDNA結(jié)合染料,與SYBRGreen I相比,該染料是一種飽和結(jié)合染料,能夠完全結(jié)合d

17、sDNA分子,可直接參加PCR反響體系中,高濃度的LC Green TMI不會抑制PCR反響。已有文獻報道在PCR反響體系中參加LCGreenTMI,使用一對引物,一個不作標記的探針,結(jié)合常規(guī)融解曲線或僅使用一對引物,PCR完畢后通過分析融解曲線的形狀和融解溫度(Tm值)的大小,對純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性(SNP)進展鑒別。LC Green TMI染料法簡便、快速、準確性高,預(yù)期將會有很好的應(yīng)用前景。1.3實時熒光定量PCR技術(shù)的開展PCR技術(shù)創(chuàng)造以來,研究人員一直致力于用其進展核酸準確定量。1991年Holland等8首次運用不可延伸的寡核苷酸雜交探針與模板結(jié)合,然后利用DNA聚

18、合酶的53核酸外切酶活性將探針切斷,使探針的能量傳遞構(gòu)造被破壞發(fā)出熒光來定量PCR產(chǎn)物。1992年Higuchi等9,10在PCR反響管中參加EB,反響進展過程中,PCR產(chǎn)物增加,EB與DNA雙鏈結(jié)合發(fā)出熒光強度也逐漸增加.他們通過連續(xù)照相動態(tài)觀察熒光強度的變化,并以此定量PCR產(chǎn)物的多少,成為最早的實時定量PCR。1996年Heid11等首先報道了Taqman PCR的原理及方法。同年,美國Applied Biosystems公司推出商用實時定量PCR(TaqmanPCR)系列。之后,人們又設(shè)計出不同的熒光探針,如分子信標技術(shù)(molecular beacon)12、Lightcycler

19、PCR13,14等。隨著研究的不斷進展,研究人員不僅定量DNA分子,還定量RNA分子,從而進一步定量基因的表達15。1.4實時熒光定量PCR的定量方法實時熒光定量PCR的定量方法有2種，即絕對定量法和相對定量法16。絕對定量法是用的標準曲線來推算未知的樣本量；相對定量法是在一定樣品中靶序列相對于另一參照序列量的變化，由于每個模板Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用起始DNA濃度的標準品即可繪制出標準曲線。絕對定量法絕對定量法指的是用的標準曲線來推算未知樣本的量，此方法要預(yù)先知道標準品的濃度。將標準品稀釋成不同濃度并作為模板進展PCR反響，以標準品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的C

20、t值為縱坐標繪制出標準曲線。對未知樣品進展定量時根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從標準曲線中推出樣品的起始拷貝數(shù)。相對定量法1比擬標準曲線的相對定量法相對定量法指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本量的變化。由于該方法中量的表達是相對于*個參照物而言的；因此，相對定量法的標準曲線比擬容易制備，對于所用的標準品只需知道其稀釋度即可。在整個試驗中，待測樣本靶序列的量來自標準曲線，最后必須除以參照物的量，其他的樣本為參照物量的n倍。在試驗中為了準確參加反響體系的RNA或DNA，通常在反響中擴增1個源管家基因作為參照基因，由于管家基因在各種組織中的恒定表達，所以可用來作為標準，比擬來源不同的樣本目的基因

21、表達量的差異。管理基因是用于比擬目的基因拷貝數(shù)，根據(jù)參照補償待測樣本核酸抽提過程中造成的目的基因損失，反響體系是否存在擴增抑制因素及參照物標準化等17。2比擬Ct值的相對定量法該方法是同時擴增待測靶基因片段和參照基因片段。這2個擴增反響可以在2個反響管中分別進展，也可以在同1個反響管中進展，測得兩者的Ct值之差即Ct。該方法不需要標準曲線，與標準曲線法不同之處在于其運用了數(shù)學(xué)公式來計算相對量，前提是假設(shè)每個循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物，以PCR反響的指數(shù)期得到Ct值來估算起始模板的量，一個循環(huán)(Ct=1)相當于起始模板數(shù)的2倍。此方法節(jié)省試劑，操作簡便，但由于是以靶基因和源控制物的擴增效率根本一致為前提

22、的，效率的偏移會影響對實際拷貝數(shù)的估計；因此，如何優(yōu)化反響體系，使得目的基因和參基因的擴增效率相等是該方法的難點。2實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用.2.1醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的運用應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測病原DNA不僅可以定性,還可以檢測出病原量的多少,為臨床診斷提供了強有力的依據(jù)?，F(xiàn)在實時熒光定量PCR已經(jīng)應(yīng)用于許多病原體的檢測,比方乙型肝炎病毒DNA18、鋒利濕疣皮損中HPVD-NA19、與鼻咽癌關(guān)系密切的EB病毒(Epstein-Banvirus)20、豬生逆轉(zhuǎn)錄酶病毒21。Andersen等22用定量PCR的方法測定了結(jié)直腸癌淋巴結(jié)的癌胚抗原(CEA)mRNA的表達量,可作為診斷癌癥微轉(zhuǎn)移的重

23、要依據(jù)。Cassinat等23應(yīng)用RQ-PCR對t(15;17)NB4白血病細胞進展了研究,其敏感性達10-6。Pongers-Willemse等24首先應(yīng)用RQ-PCR對4例前B細胞ALL中IgH/TCR重排進展了研究,他們針對每個病例設(shè)計一個與連接區(qū)互補的等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針和各自特異性的一對引物,比擬了RQ-PCR與斑點雜交和液相雜交檢測的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其敏感性與斑點雜交相似(10-310-5),但低于液相雜交。敬忠等報道使用dsDNA結(jié)合染料SYBRGreen I，結(jié)合融解曲線分析對A-地中海貧血純合子、雜合子作出診斷25。使用雙色熒光標記探針,結(jié)合不同的引物設(shè)計，可

24、以實現(xiàn)對*些先天性疾病的定量檢測。衛(wèi)東等26通過熒光定量的方法對各細胞株的轉(zhuǎn)錄因子T-bo* e*-pression in T cells (T-bet)、GATA3的表達水平進展檢測,建立了腫瘤細胞株轉(zhuǎn)錄因子基因表達的熒光定量PCR檢測方法,較常規(guī)PCR方法更為簡便、快速、準確,有很好的應(yīng)用前景。2.2食品研究運用實時熒光定量PCR技術(shù)可以對食品中致病菌進展檢測。光偉27等采用沙門菌fimY基因序列，設(shè)計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門菌的FQ-PCR方法。胡建華等根據(jù)Grenbank公布的志賀菌ipaH基因的保守序列設(shè)計特異性引物，篩選適宜的DNA模板制備方法嗎，以SABH Green

25、染料監(jiān)控熒光變化的FQ-PCR與常規(guī)PCR結(jié)合,檢測培養(yǎng)液和牛奶陽性樣品中的志賀菌28。FQ-PCR技術(shù)除了在微生物檢測中應(yīng)用廣泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作為微生物生理代、菌群分布、菌株鑒定等的研究工具。同時PCR技術(shù)是檢測轉(zhuǎn)基因食品最方便快捷的方法，基于轉(zhuǎn)基因特異DNA片段的FQ-PCR篩選方法已被一些國家作為相關(guān)食品法規(guī)的標準檢測方法。日本和美國等13個實驗室聯(lián)合采用FQ-PCR方法對5種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆進展了定量研究。結(jié)果說明這種方法可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物標識制度的實際檢測29。2.3 植物研究上的運用傳統(tǒng)的病原菌檢測方法依賴于病癥觀察、孢子或菌落計數(shù)等手段。與傳

26、統(tǒng)方法相比，實時定量PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，不受植物病癥的限制，能區(qū)分細微差異。目前該技術(shù)在植物病原菌檢測中得到越來越廣泛的應(yīng)用。如伍等30根據(jù)西瓜細菌性果斑病菌Acidovor a*avenae subsp. citrulli與相關(guān)細菌16S rDNA序列差異，設(shè)計出對西瓜細菌性果斑病菌具有穩(wěn)定點突變特異性探針Aac-probe，利用該探針對23種供試菌株進展了實時熒光PCR檢測試驗。植物抗病性及其機制研究一直是當今植物病理學(xué)和植物抗病育種研究工作中的熱點和焦點問題。而抗病基因的研究是植物抗病性及其機制研究的根底，運用熒光定量PCR技術(shù)可檢測轉(zhuǎn)入抗病基因的植株中病毒的積累31，

27、從而比擬抗病植株與感病植株之間的病毒復(fù)制和積累的差異，為抗病基因抑制病毒的復(fù)制和運動提供強有力的分子證據(jù)。3實時熒光定量PCR的展望實時熒光定量PCR技術(shù)自1996面世以來,短短的幾年就被廣泛應(yīng)用到生物學(xué)各個領(lǐng)域,涉及到的圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量,核酸多態(tài)性分析,基因突變分析等多個領(lǐng)域。但隨著該技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域圍不斷擴大延伸，研究的層次不斷深入，它也開場顯現(xiàn)出缺乏:(1)降低探針制備的本錢或開掘新的熒光染料；(2)進一步提高分析的靈敏度及實驗重復(fù)性；(3)樣品制備簡單化,程序化和機械化以節(jié)約時間降低本錢。相信,實時熒光定量PCR將以其獨特的優(yōu)勢在分子生物學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的根底研究

28、和應(yīng)用研究方面發(fā)揮更多更大的作用。另外,基因分析的定量化和均相化是未來基因診斷的開展趨勢,目前在該領(lǐng)域的研究剛剛開場,仍有許多問題需要解決,如分析靈敏度及重復(fù)性問題、自動化儀器和試劑本錢、樣品處理及多基因同時分析等問題。生物芯片技術(shù)與熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合將有助于上述問題的解決32,屆時將大大推動該技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用普及,特別是臨床診斷領(lǐng)域的推廣。隨著科學(xué)技術(shù)與科學(xué)知識的增長，實時熒光定量PCR技術(shù)將繼續(xù)被改良，新的問題被攻克，從而建立更新、更便捷、更完善的PCR體系，并應(yīng)用到更廣、更深的科學(xué)領(lǐng)域。參考文獻1歐陽松應(yīng),冬,歐陽紅生等.實時熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用J.生命的化學(xué), 200

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