CjFRO2在轉(zhuǎn)基因枳中的整合與表達(dá)

1、CjFRO2在轉(zhuǎn)基因枳中的整合與表達(dá)論文導(dǎo)讀:：枳砧有很多顯著的優(yōu)點。雜交分析。在轉(zhuǎn)基因枳中的整合與表達(dá)。論文關(guān)鍵詞：香橙三價鐵螯合物復(fù)原酶基因，枳，Southern雜交分析，Real-TimePCR表達(dá)分析鐵是植物生長必需的營養(yǎng)元素，在植物的光合作用和呼吸作用中起著重要作用。鐵與葉綠體片層結(jié)構(gòu)形成有關(guān)，缺鐵時，葉綠體的片層結(jié)構(gòu)減少，葉綠素合成受阻，葉片失綠黃化。盡管土壤中鐵的含量非常豐富，但幾乎都是以難溶于水的Fe3+形式存在，不易被植物吸收利用。為了獲得充足的鐵，雙子葉植物通過一個機(jī)理;的鐵吸收系統(tǒng)吸收難溶的Fe3+：(1)分泌質(zhì)子和有機(jī)酸酸化根表周圍，溶解更多的Fe3+ ，(2) 合成三

2、價鐵螯合物復(fù)原酶Ferric-chelatorreductase生物論文，F(xiàn)CR，將溶解的Fe3+復(fù)原成Fe2+的 (3)利用高親和性的Fe2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)將Fe2+轉(zhuǎn)運到根表細(xì)胞內(nèi)。同時還伴隨根尖膨大、根毛增多、根表產(chǎn)生轉(zhuǎn)移細(xì)胞等生理生化現(xiàn)象來增強(qiáng)吸收土壤中難溶的三價鐵【1】, 【2】,【3】。三價鐵螯合物復(fù)原酶的復(fù)原過程是植物鐵吸收中非常關(guān)鍵的一步，是植物鐵吸收過程中的限速步驟【4】。從擬南芥、番茄、蘋果和柑桔等作物的研究說明，三價鐵螯合物復(fù)原酶基因的表達(dá)對提高作物的耐鐵脅迫能力相關(guān)性很大，組成型表達(dá)三價鐵螯合物復(fù)原酶基因的植株較野生型植株在低鐵條件下生長得更好【5】。目前已經(jīng)有多個植物三價鐵

3、螯合物復(fù)原酶基因被克隆出來【6】, 【7】, , , ，為植物耐缺鐵改進(jìn)提供了良好的根底。研究發(fā)現(xiàn)，在缺鐵脅迫下，轉(zhuǎn)入高效的外源三價鐵螯合物復(fù)原酶基因材料的三價鐵螯合物復(fù)原酶活性、葉片中有效鐵的含量和葉綠素含量較非轉(zhuǎn)基因材料明顯提高，葉片黃化程度較對照材料更輕或未黃化，植株對缺鐵的耐受能力更強(qiáng)；且在正常供鐵情況下，轉(zhuǎn)基因材料的葉片中有效鐵的含量和葉綠素含量較非轉(zhuǎn)基因材料也明顯提高, , ,。因此，利用三價鐵螯合物復(fù)原酶基因提高植物的鐵吸收能力，為不耐缺鐵植物的改進(jìn)提供了一條有效的途徑論文格式模板。果樹是受鐵脅迫影響最為嚴(yán)重的作物之一，大多數(shù)種植的果樹樹種都有缺鐵黃化的報道。果樹為多年生植物，種

4、植在固定的地點上，比一年生的植物更容易受鐵脅迫影響。研究發(fā)現(xiàn)果樹種屬間耐缺鐵的能力差異很大，在鐵脅迫時，耐缺鐵品種根系三價鐵螯合物復(fù)原酶活性明顯強(qiáng)于不耐缺鐵品種23, ,。枳(Poncirus trifoliate (L.) Raf.)是目前國內(nèi)應(yīng)用最多、最廣的柑橘砧木。枳砧有很多顯著的優(yōu)點，但枳不耐缺鐵，堿性土地區(qū)枳砧柑橘會發(fā)生缺鐵黃化，造成減產(chǎn)甚至無產(chǎn)。香橙是表現(xiàn)最好的柑橘耐堿砧木之一，能耐受pH7.5以上的堿性土壤, 。香橙在缺鐵脅迫下，三價鐵螯合物復(fù)原酶活性在脅迫4周時即到達(dá)最強(qiáng)生物論文，增強(qiáng)約20倍；而在田間表現(xiàn)極易缺鐵的枳在鐵脅迫4周時，三價鐵螯合物復(fù)原酶活性僅增加約3倍，葉片葉綠

5、素含量顯著低于香橙, 。2004年以來，本室與西南大學(xué)生物技術(shù)中心合作，從耐缺鐵柑橘砧木資陽香橙(Citrusjunos Sieb. ex Tanaka)中克隆了與耐缺鐵性狀相關(guān)的三價鐵螯合物復(fù)原酶基因CjFRO2，DQ985810.1，并利用該基因開展柑橘耐缺鐵基因工程育種工作。本研究利用包含CaMV 35S-CjFRO2組成型表達(dá)單元的表達(dá)載體pBIcjFRO2，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CjFRO2基因?qū)腓字小Ｍㄟ^PCR驗證，Southern雜交分析，Real-Time表達(dá)分析，篩選目的基因已經(jīng)整合入枳基因組中且表達(dá)正常的轉(zhuǎn)基因枳株系，為培育耐缺鐵優(yōu)良柑橘砧木新品種奠定根底，同時為創(chuàng)造鐵高

6、效和富含鐵營養(yǎng)農(nóng)作物新品種提供科學(xué)依據(jù)和應(yīng)用實例。1.材料與方法1.1實驗材料從成熟枳果實中取出種子，在超凈工作臺上用含有0.1% Tween 20的次氯酸鈉溶液消毒10分鐘，然后用滅菌水沖洗3遍，剝?nèi)シN皮，接種在MS固體培養(yǎng)基上，28暗培養(yǎng)20天左右，取生長旺盛的枳上胚軸作轉(zhuǎn)化受體用。1.2表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化菌株表達(dá)載體pBIcjFRO2(圖1，由西南大學(xué)生物技術(shù)中心裴炎教授提供)。以植物常用表達(dá)載體pBI121為根底，切去gusA基因序列，引入CjFRO2基因的完整cDNA序列，構(gòu)建一個以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPTII為篩選標(biāo)記、包含CaMV 35S-CjFRO2組成型表達(dá)單元的表達(dá)載體。用電擊法

7、將該表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中生物論文，挑取陽性單克隆，用含硫酸鏈霉素125 ug/ml和卡那霉素50 ug/ml的LB液體培養(yǎng)培養(yǎng)過夜。在過夜培養(yǎng)的菌液中參加終濃度為15%的甘油，-70冷凍保存。轉(zhuǎn)化前取-70冷凍保存的菌株，在含硫酸鏈霉素125 ug/ml和卡那霉素50 ug/ml的LB固體培養(yǎng)培養(yǎng)上劃線培養(yǎng)，28暗培養(yǎng)36 h后挑取單克隆，用含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，用含有100 uM乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基重新懸浮，待農(nóng)桿菌濃度到達(dá)5x108 CFU/ml時用于枳殼上胚軸轉(zhuǎn)化。圖1 表達(dá)載體pBIcjFRO2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖Fig 1 Map of

8、 plasmid pBIcjFRO21.3轉(zhuǎn)化方法無菌條件下將生長良好的枳上胚軸切成長約1 cm左右的小段，在農(nóng)桿菌懸浮液中侵染15min , 取出用無菌濾紙吸干剩余菌液，在含有100 uM乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中26暗培養(yǎng)3d 后, 轉(zhuǎn)移到含100 ug/ml卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基MS + BA 6mg/l + 0.1 mg/lNAA中進(jìn)行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)基中同時參加500 mg/l羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌的生長。培養(yǎng)溫度為26，光照度2000 Lx(16h/d)。 15天后將外植體轉(zhuǎn)入含0.5 mg/l NAA的MS篩選培養(yǎng)其中繼續(xù)培養(yǎng)。待不定芽莖長于1cm后，將不定芽切下誘導(dǎo)生根論文格式模板

9、。1.4轉(zhuǎn)化苗的PCR檢測切取經(jīng)生根培養(yǎng)的擬轉(zhuǎn)化芽葉片約20 mg約1 cm2，用DNA微量提取法提取DNA。由于枳基因組中存在內(nèi)源三價鐵螯合物復(fù)原酶基因，故根據(jù)CaMV 35S-CjFRO2基因表達(dá)單元結(jié)構(gòu)設(shè)計特異PCR檢測引物，上游引物位于CaMV 35S啟動子序列，下游引物位于CjFRO2基因序列，引物序列為：FRO2-1：5- TTC GCA AGA CCC TTC CTC TA -3；FRO2-2：5- TTC GCT CCA TTC TAG CAC CT -3，擴(kuò)增片段長度為768 bp。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測， pBIcjFRO2質(zhì)粒作陽性對照，非轉(zhuǎn)化枳作陰性對照

10、，水作空白對照。將PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)化苗經(jīng)練苗后移載于溫室中生物論文，培育成植株。1.5轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交分析為了確認(rèn)CjFRO2基因已經(jīng)整合入轉(zhuǎn)化枳基因組中及其在基因組中的拷貝數(shù)，對PCR檢測為陽性的擬轉(zhuǎn)化枳進(jìn)行Southern雜交分析。取擬轉(zhuǎn)化枳的葉片組織提取基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶ClaI 30酶切6 h每微克DNA參加5U內(nèi)切酶，在0.8%的瓊脂糖凝膠上電流別離，每孔上樣25 ug，在TAE緩沖液中以1 V/cm的電壓電泳16 h。經(jīng)HCl脫嘌呤、NaOH中和及Tris-HCl平衡后用高鹽20 xSSC法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，尼龍膜用紫外交聯(lián)儀固定。用Roche地高

11、辛探針標(biāo)記試劑盒DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I (for color detection with NBT/BCIP)進(jìn)行Southern雜交，具體操作方法見試劑盒說明書。因為枳基因組中存在內(nèi)源三價鐵螯合物復(fù)原酶基因，故采用CjFRO2基因表達(dá)單元的CaMV 35S啟動子序列作為探針模板。探針引物為35SL：5- GGT AGT TCC CAC TGA ATC AA-3；35SR：5- GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3，探針模板長500 bp。1.6轉(zhuǎn)化植株的Real-Time PCR分析取轉(zhuǎn)

12、CjFRO2基因枳根尖細(xì)嫩組織，用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取根尖局部總RNA，將RNA濃度稀釋為500 ng/L。用PrimeScriptTM RTreagents Kit TakaraCode:DRR037S試劑盒合成cDNA。SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR反響。反響體系為：SYBR Premix Ex TaqTM2x12.5L，PCR上游引物10M0.5L ，PCR下游引物10M0.5L ，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 L，ddH2O滅菌雙蒸水10.5L。反響條件為：95預(yù)變性90s；95，30s，57，20s，72，20s，40個循環(huán)；

13、72，60s。PCR反響在美國BIO-RAD iQ5 實時PCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行。用actin基因作內(nèi)標(biāo)生物論文，actin上游引物：5- CAT CCC TCA GCA CCT TCC -3；下游引物：5- CCA ACC TT A GCA CTT CTC C -3，產(chǎn)物長198 bp。CjFRO2基因上游引物：5 - TCA AAT CCA TCA GACTCA CCG -3，下游引物：5- AGA AAC GAG TGA CAA TGC CC -3， 產(chǎn)物長198 bp。每個樣品做3個重復(fù)，以10倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)基因枳根總cDNA分別建立actin和CjFRO2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。Real-Ti

14、me PCR反響完成后并分析產(chǎn)物的融解曲線，凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性論文格式模板。采用Delta Delta Ct法分析實驗數(shù)據(jù)，確定CjFRO2基因的相對表達(dá)量。2.結(jié)果與分析2.1擬轉(zhuǎn)化枳的PCR鑒定對生根培養(yǎng)的擬轉(zhuǎn)化苗用CjFRO2基因表達(dá)單元的特異引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，陽性擬轉(zhuǎn)化苗的PCR擴(kuò)增片段與質(zhì)粒擴(kuò)增片段一致，都在750 bp左右的區(qū)域有一條特異性的條帶，而陰性對照和水中未能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶(圖2)，初步判斷CjFRO2基因已整合到枳的基因組中。將陽性擬轉(zhuǎn)化苗種植于隔離溫室中，培育成植株。1 2 3 45 6 7 8 9 1011 12 13 14 15 16 76

15、8bp 圖2 局部轉(zhuǎn)CjFRO2基因枳的PCR檢測結(jié)果Fig 2 PCR detection of putative transformed plants of Poncirustrifoliate112: 擬轉(zhuǎn)化枳; 13: DL2000; 14: pBIcjFRO2;15:非轉(zhuǎn)化枳對照; 16: 水對照15: putative transformed Poncirus trifoliate; 6:pBIcjFRO2; 7: Poncirus trifoliate; 8: water; M: DL20002.2擬轉(zhuǎn)化枳的Southern雜交分析為確認(rèn)CjFRO2基因已經(jīng)整合入轉(zhuǎn)化枳基因組中及

16、其拷貝數(shù)，隨機(jī)抽取8株P(guān)CR陽性擬轉(zhuǎn)化枳，分別命名為PT1PT8，對其進(jìn)行Southern雜交分析。Southern雜交結(jié)果顯示(圖3)，非轉(zhuǎn)基因枳對照沒有雜交信號，而局部擬轉(zhuǎn)化枳中有特異雜交信號，雜交條帶大小都大于4.6 kb，與預(yù)測的雜交信號位置一致。其中PT2、PT3、PT5和PT8只有一個雜交條帶，推測CjFRO2基因以單拷貝形式整合入其基因組中；PT1和PT6有2個雜交條帶，推測CjFRO2基因以雙拷貝形式整合入其基因組中；而PT4和PT7中未發(fā)現(xiàn)雜交條帶，推測其為PCR假陽性生物論文，CjFRO2基因未整合入其基因組中。M 1 23 4 5 6 7 8 9 4.6 kb 圖3 局部

17、轉(zhuǎn)CjFRO2基因枳的Southern雜交分析Fig 3 Southern blot of putative transformed plants of PoncirustrifoliateM: DNA/Eco130I(StyI); 1: 非轉(zhuǎn)化枳對照; 29: 擬轉(zhuǎn)化枳M: DNA/Eco130I(StyI); 1: Poncirustrifoliate; 310: putativetransformed Poncirus trifoliate;2.3轉(zhuǎn)CjFRO2基因枳的表達(dá)分析圖4 轉(zhuǎn)基因枳PTF2、PT3、PT5和PT8根尖CjFRO2基因表達(dá)的Real-time PCR分析Fig4R

18、eal-Time PCR analysis of the expression of CjFRO2 in PT2, PT3, PT5 and PT82.4CjFRO2基因表達(dá)穩(wěn)定性分析圖5 轉(zhuǎn)基因枳PT2株系無性繁殖后代CjFRO2基因Real-time PCR分析結(jié)果Fig4 Real-Time PCR analysis of the expression of PT2 and its clonal descendents3.討論缺鐵黃化嚴(yán)重影響柑橘果實的商品性能及經(jīng)濟(jì)價值，目前全國30%的柑橘種植區(qū)存在不同程度的缺鐵黃化現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)開展。傳統(tǒng)防治柑橘缺鐵的方法主要集

19、中在噴施葉面肥、樹干注射、改進(jìn)土壤、靠接耐缺鐵砧木等常規(guī)栽培方法上，這些方法需要花費大量的人力、物力，且很難到達(dá)理想的效果，無法從根本上解決柑橘缺鐵黃化的問題。培育并推廣耐缺鐵優(yōu)良新品種是最根本和最有效的解決柑橘缺鐵黃化的有效方法。柑橘是多年生木本植物，常規(guī)育種途徑培育耐缺鐵柑橘新品種難度很大，國內(nèi)外迄今尚未見柑橘耐缺鐵育種成功的報道。植物基因工程的迅速開展為柑橘品種改進(jìn)開辟了一條新途徑，為柑橘耐缺鐵育種提供了一個有效的方法。三價鐵螯合物復(fù)原酶基因的高效表達(dá)是植物耐鐵脅迫的重要因素論文格式模板。早期在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)生物論文，三價鐵螯合物復(fù)原酶基因是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在正常供鐵情況下，轉(zhuǎn)35S-FR

20、O2擬南芥株系FRO2基因在mRNA水平上積累，但根系外表三價鐵螯合物復(fù)原酶活性并未增加；在鐵脅迫下，轉(zhuǎn)入35S-FRO2的株系的根系三價鐵螯合復(fù)原酶的活性增強(qiáng)幅度較野生型更大，植株的生長情況更好，說明在擬南芥中組成型表達(dá)三價鐵螯合復(fù)原酶基因能提高其耐鐵脅迫能力10。但后來的研究證明，三價鐵螯合物復(fù)原酶基因并非在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，而是在轉(zhuǎn)錄水平上受FIT、AtbHLH38、AtbHLH38等轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)，在擬南芥中組成型表達(dá)FIT/AtbHLH38或FIT/AtbHLH38轉(zhuǎn)錄因子的實驗發(fā)現(xiàn)，在正常供鐵和缺鐵脅迫兩種情況下，轉(zhuǎn)基因植株FRO2基因都能有效表達(dá)，在其根系中都能檢測到較強(qiáng)

21、的復(fù)原酶活性, 。在番茄中組成型表達(dá)FRO2基因說明，與對照相比，在正常供鐵情況下，轉(zhuǎn)基因番茄根系FRO2基因表達(dá)量增加，鐵螯合物復(fù)原酶活性增強(qiáng)了1.75倍，葉片中有效鐵的含量增加了1倍；在鐵脅迫情況下，轉(zhuǎn)基因植株根系酶活性增強(qiáng)了1倍，葉片中有效鐵的增加了0.5倍14。在八楞海棠中組成型表達(dá)FRO2基因也發(fā)現(xiàn)在正常供鐵情況下，轉(zhuǎn)基因植株根系鐵螯合物復(fù)原酶活性是對照的1.875倍，在缺鐵脅迫下為2.182倍。以上的結(jié)果說明，在植物中組成型表達(dá)三價鐵螯合物復(fù)原酶基因可以有效地增強(qiáng)其根系三價鐵螯合物復(fù)原酶的活性生物論文，提高轉(zhuǎn)基因植株中鐵吸收能力。本研究將35S啟動子控制下的在鐵脅迫下高效表達(dá)的資陽

22、香橙三價鐵螯合物復(fù)原酶基因CjFRO2轉(zhuǎn)入枳中，Real-Time PCR分析說明，4個單拷貝的轉(zhuǎn)基因株系中CjFRO2基因都能組成型表達(dá)，為提高轉(zhuǎn)基因枳吸收鐵的能力奠定了根底。外源基因能否在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定遺傳與表達(dá)是影響轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用前景的重要因素。枳通過珠心胚無性性繁殖，無性繁殖后代有較強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性，外源基因在代間表達(dá)一致性更好。對菊花、馬鈴薯和白楊等的無性繁殖后代的遺傳穩(wěn)定性研究說明，外源基因的表達(dá)保持很強(qiáng)的穩(wěn)定性和可預(yù)測性, , 。本研究中CjFRO2基因在三代轉(zhuǎn)基因枳中的表達(dá)也非常穩(wěn)定，說明轉(zhuǎn)入CjFRO2基因能在枳中穩(wěn)定遺傳與表達(dá)。4.結(jié)論三價鐵螯合物復(fù)原酶是堿性土地區(qū)植物鐵吸收

23、的關(guān)鍵酶，能將難以被植物吸收的Fe3+復(fù)原為易被植物根系吸收的Fe2+。利用在鐵脅迫中高效表達(dá)的香橙CjFRO2基因在枳基因組中的組成型表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因枳的鐵吸收能力，為進(jìn)一步培育耐缺鐵優(yōu)良枳砧木，改進(jìn)枳砧柑橘在堿性土壤地區(qū)因缺鐵而引起的黃化、低產(chǎn)的問題，增強(qiáng)枳砧柑橘栽培的適應(yīng)性，擴(kuò)大枳砧柑橘種植面積開辟了一條新途徑。同時為提高轉(zhuǎn)CjFRO2基因枳砧柑橘果實品質(zhì)，增加果實中鐵的含量，滿足人們對鐵的需求作出嘗試。參考文獻(xiàn)References:Guerinot, M L, Yi, Y. Irion: nutritious, noxious and readilyavailable . Plant

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