亞硝酸鹽的測定

1、一、目的與要求：1、明確亞硝酸鹽的測定與控制成品質(zhì)量的關(guān)系。2、明確與掌握鹽酸萘乙二胺法的基本原理與操作方法。二、原理：樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)，除去脂肪后，在弱酸條件下硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮化合物， 再與萘基鹽酸二氨乙烯偶聯(lián)成紫紅色的重氮染料，產(chǎn)生的顏色深淺與亞硝酸根含量成正比，可以比色測定。 反應(yīng)式如下：No?+2H*，H3N So J1= N*SOiH42HiONO一SoJkNHCFli IbNIL* 2Hcl(紫紅色)三、試劑與儀器1、亞鐵氤化鉀溶液：稱取106克亞鐵氤化鉀K4Fe9(CN)5.3H2O，溶于水后，稀釋至1000毫升。2、乙酸鋅溶液：稱取220克乙酸鋅Zn(C

2、H2C00)22H20，加30毫升冰乙酸溶于水，并稀釋至1000 毫升。3、飽和硼砂溶液：稱取5克硼酸鈉(Na2B0710H20)，溶于100毫升熱水中，冷卻后備用。4、0.4%對氨基苯磺酸溶液：稱取0.4克對氨基苯磺酸，溶于100毫升20%的鹽酸中，避光保存。5、0.2%鹽酸萘乙二胺溶液：稱取0.2克鹽酸萘乙二胺，溶于100毫升水中，避光保存。6、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取0.1000克于硅膠干燥器中干燥24小時(shí)的亞硝酸鈉，加水溶解移入 500毫升容量瓶中，并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于200微克亞硝酸鈉。7、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00毫升，置于200毫升容量

3、瓶中，加水 稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于5微克亞硝酸鈉。8，小型絞肉機(jī)。9、分光光度計(jì)。四、操作方法：1、樣品處理：稱取5.0克經(jīng)絞碎混勻的樣品，置于50毫升燒杯中，加工12.5毫升飽和溶液，攪拌均 勻，以70C左右的水約300毫升將樣品全部洗入500毫升容量瓶中，置沸水浴中加熱15分鐘，取出后冷 至室溫，然后一面轉(zhuǎn)動(dòng)一面加入5毫升亞鐵氤化鉀溶液，搖勻，再加入5毫升乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)， 加水至刻度，混勻，放置0.5小時(shí)，除去上層脂肪，清液用濾紙過濾棄去初濾液30毫升，濾液備用。2、測定吸取40毫升上述濾液于50毫升比色管中，另吸取0.00、0.20、0. 40、0. 60、0.80、1.

4、00、1.50、 2.00、2.50毫升亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0、1、2、3、5、7、10、12.5微克亞硝酸鈉)，分別置于50 毫升比色管中，于標(biāo)準(zhǔn)與樣品管中分別加入2毫升0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3-5分鐘后各加 入1毫升0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15分鐘，用2厘米比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)， 于波長538nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。計(jì)算： X=(AX1000)/(mX40/500X1000X1000)X：樣品中亞硝酸鹽的含量，g/kg；m： 樣品質(zhì)量，g；A：測定用樣液中亞硝酸鹽的含量，ug.Qq乳與乳制品中亞硝酸鹽的測定：亞硝酸鹽廣泛存在于自然界，

5、在乳與乳制品中都有一定的含量。現(xiàn)已證明，亞硝酸鹽與食品 中固有的胺類化合物是產(chǎn)生致癌物質(zhì)-亞硝胺的前體物質(zhì)，是潛在的致癌物質(zhì)，亞硝酸鹽含 量過高會(huì)引起高鐵蛋白癥。因此，對乳與乳制品亞硝酸鹽含量的檢測和控制是非常有必要的。 在乳與乳制品測定亞硝酸鹽的過程中，將樣品沉淀脂肪和蛋白質(zhì)后，進(jìn)行過濾。在濾液中加 入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二鹽酸鹽，使其顯粉紅色，然后用分光光度計(jì)在其最大吸收波長 538nm下測定其吸光度。將測得的吸光度與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度進(jìn)行比較定量。 1主要試劑和儀器1.1儀器：UV2550型紫外可見分光光度計(jì)(島津有限公司)1.2試劑：標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液：GBW (E) 0

6、802230504水中亞硝酸鹽-氮,濃度：100mg/mL，并逐級稀釋 為0.9857g/m!的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；硫酸鋅溶液：535g/L;亞鐵氰化鉀溶液：172g/L;鹽酸-氨水緩沖溶液：pH9.69.7；顯色液1：鹽酸：水=450: 550 (V： V)鹽酸溶液；顯色液2： 5g/L磺胺溶液；顯色液3： 1g/L萘胺鹽酸鹽溶液。試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為去離子水。2試驗(yàn)方法2.1入射光波長的選擇國標(biāo)GB/T5413.32-1997乳粉硝酸鹽、亞硝酸鹽的測定中規(guī)定最大吸收波長為538nm, 但在實(shí)驗(yàn)過程中，做光譜掃描時(shí)，最大吸收波長往往因?yàn)闃悠返牟煌l(fā)生變化，發(fā)上紅移 或藍(lán)移的現(xiàn)象?？紤]

7、到測定的靈敏度，應(yīng)采用最大吸收波長作為入射光波長。所以，在進(jìn)行 定量分析之前，應(yīng)先才用光譜掃描進(jìn)行峰形和峰位的確認(rèn)。以表1的儀器條件，對亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行掃描，光譜圖如圖1。圖1中曲線均比較平滑， 為了消除干擾組分的吸收，采用“吸收最大，干擾最小”的原則，即所選擇的測定波長處待測 組分的吸收最大，但干擾組分的吸收最小；從消除非單色光引起的對郎伯比爾定律的偏離角 度考慮，應(yīng)選用吸收曲線比較平坦部分對應(yīng)波長的光作為入射光波長。綜上所述，應(yīng)選擇圖1中538nm作為入射光波長，與國家標(biāo)準(zhǔn)一致。波長掃描范圍/詢420650光譜帶寬/口隊(duì)0, 5采樣間隔0,費(fèi)掃描速度廠中速小-圖1標(biāo)準(zhǔn)系列吸收光譜圖2.

8、2標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6個(gè)50mL容量瓶，分別加入濃度為0.9857gg/mL的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn) 貯備液0.0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，加水至20mL，然后依次加入3mL顯色液1，2.5mL 顯色液2,混合均勻后，靜置5min,加1mL顯色液3,靜置5min，用去離子水定容至刻度, 此溶液濃度分別為 0.00、9.86、19.72、59.14、98.56、197.1卻g/L。靜置 5min 后于 538nm 處， 用1cm比色皿進(jìn)行測定，并以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）圖2亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0011C-0.0005,相關(guān)系數(shù)r2

9、=0.9999。2.3樣品測定2.3.1樣品前處理稱90.0g左右牛乳樣品，按順序加入25mL硫酸鋅溶液，25mL亞鐵氰化鉀溶液，40mL鹽酸 -氨水緩沖溶液，每加一種試劑充分混合，用去離子水定容于250mL容量瓶中，靜置40min, 用定性中速濾紙過濾后收集濾液。2.4.2樣品測定移取20mL濾液于50mL容量瓶中，加3mL顯色液1，2.5mL顯色液2，搖勻，靜置5min； 加1mL顯色液3，靜置5min，定容后靜置5min，上機(jī)測定。3結(jié)果與討論干擾消除一般有兩種方法，一類是不分離的情況下消除干擾，另一類是分離雜質(zhì)消除干擾。 因?yàn)樵诜蛛x過程中，會(huì)造成硝酸鹽和亞硝酸的損失，所以一般在不分離的

10、情況下消除干擾。 本試驗(yàn)采用雙光束分光光度法，在不分離的情況下消除干擾。3.1在樣品前處理后，在濾液中的某些成分影響被測組分吸光度時(shí)，將構(gòu)成干擾，影響測量 結(jié)果的準(zhǔn)確性。干擾離子與試劑生成有色配合物，使測定結(jié)果偏高；干擾離子與試劑反應(yīng)， 生成的配合物雖然無色，但消耗大量的顯色劑，使被測離子的顯色反應(yīng)不完全，使測定結(jié)果 偏低；與被測離子結(jié)合成離解度小的另一種化合物，使被測離子與顯色劑不反應(yīng)，使測定結(jié) 果偏低。加入鹽酸-氨水緩沖溶液，控制溶液的酸度，從而有效的消除了干擾。因?yàn)榭刂迫芤核岫仍?一定范圍，可以使亞硝酸鹽與顯色劑反應(yīng)，干擾離子不能生成有色化合物。3.2選擇適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?，消除顯色劑本身顏

11、色和某些共存的有色離子的干擾。干擾離子本 身有顏色，使測定結(jié)果偏高；本試驗(yàn)選擇溶劑參比和試液參比分別進(jìn)行考察：溶劑參比：當(dāng)顯色劑及其他溶劑均無色， 被測溶液中又無其他有色離子時(shí)，可用溶劑-去離子水做參比溶液。試液參比：顯色劑無色， 被測溶液中有其他有色離子，可采用不加顯色劑的被測溶液做參比溶液。以去離子水作溶劑參比，只能消除吸收池壁對光的反射和散射所帶來的干擾；以被測溶 液作試液參比，不僅能消除吸收池壁對光的反射和散射帶來的干擾，還能消除濾液中共存離 子對光的選擇性吸收所帶來的干擾。所以采用不加顯色劑的濾液作試液參比。3.3選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL消除干擾。入射光波長的選擇必須從靈敏度與選擇性兩方面來考

12、慮，從吸收曲線的峰形來看，無雜峰干 擾，應(yīng)選擇最大吸收波長進(jìn)行測定，這樣靈敏度高，偏離郎伯-比爾定律的程度較小。本實(shí) 驗(yàn)通過光譜掃描，從吸收光譜圖上測定最大吸收波長后進(jìn)行定量分析，避免了波長偏差帶來 的誤差和干擾。3.4精密度試驗(yàn)分別稱取純牛乳、原味酸牛乳、全脂乳粉和乳清蛋白粉樣品，用上述方法進(jìn)行測定，計(jì)算結(jié) 果見表2：（單位：以g/LQs三、酸牛乳中亞硝酸鹽測定的背景干擾及消除方法1前言亞硝酸鹽是潛在的致癌物質(zhì)，而乳與乳制品中亞硝酸鹽含量過高會(huì)引起高鐵蛋白癥，因而要 嚴(yán)格控制其含量1。酸牛乳中由于含有各式各樣的食品添加劑，在測定亞硝酸鹽過程中， 用硫酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀不完全，導(dǎo)致部分小分子

13、物質(zhì)進(jìn)入濾液，使濾液渾濁，而這種渾 濁一般是肉眼不可見的。在分光光度計(jì)上比色時(shí)，卻能引起吸收，導(dǎo)致測定結(jié)果偏高，造成 假陽性的情況。筆者針對此種情況，建立了以濾液為參比溶液，消除酸牛乳中細(xì)小顆粒對檢測結(jié)果的影 響，結(jié)果令人滿意。2試驗(yàn)部分2.1儀器和試劑 2.1.1儀器：UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（島津有限公司）2.1.2試劑：標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液：GBW（E）0802230504水中亞硝酸鹽-氮,濃度：100mgmL-1,并逐級稀釋 為0.9857m gmL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；硫酸鋅溶液：535gL-1;亞鐵氰化鉀溶液：172gL-1;鹽酸- 氨水緩沖溶液：pH9.69.7；顯色液1：鹽酸

14、：水=450： 550（V： V）鹽酸溶液；顯色液2： 5gL-1磺胺溶液；顯色液3： 1gL-1萘胺鹽酸鹽溶液。試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為去離子水。2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6個(gè)50mL容量瓶，分別加入濃度為0.9857m gmL-1的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)貯 備液0，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，加水至20mL，并做空白試驗(yàn)，然后依次加入3mL 顯色液1，2.5mL顯色液2,混合均勻后，靜置5min,加1mL顯色液3,靜置5min，用去離子 水定容至刻度，此溶液濃度分別為0.00、9.86、19.72、59.14、98.56、197.14m g L-1。 靜置5m

15、in后于538nm處，用1 cm比色皿進(jìn)行測定。2.3試驗(yàn)過程2.3.1吸收光譜曲線的繪制在光譜模式下，測定標(biāo)準(zhǔn)系列的光譜圖，儀器條件見表1。波長掃描范圍皿420飛30一光譜帶寬，0.5采樣間隔0. 5掃描速度中速在此儀器條件下，掃描出標(biāo)準(zhǔn)系列的吸收光譜圖，見圖1。0.25U0.000420.000.2ULI0.1500.1 OU0.05U500.0055C .00600.00650.00波長him圖1標(biāo)準(zhǔn)系列吸收光譜圖2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在光度測定模式下，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。工作曲線方程為 A= 0.0011C - 0.0005，相關(guān)系數(shù) r2=0.999

16、9。圖2亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線2.2樣品測定2.2.1樣品前處理將酸牛乳樣品混合均勻后，稱70g左右樣品，按順序加入35mL硫酸鋅溶液，35mL亞鐵氰化 鉀溶液，50mL鹽酸-氨水緩沖溶液，每加一種試劑充分混合，用去離子水定容于250mL容量 瓶中，靜置40min，用定性中速濾紙過濾后收集濾液。2.2.2樣品測定移取20mL濾液于50mL容量瓶中，加3mL顯色液1，2.5mL顯色液2，搖勻，靜置5min；加 1mL顯色液3,靜置5min，定容后靜置5min，上機(jī)。同時(shí)移取20mL濾液于50mL容量瓶中做 為參比溶液，加水定容至刻度，搖勻后靜置，與樣品同測，測定結(jié)果見表1表2-樣品測定數(shù)據(jù)丫5樣品質(zhì)量

17、(、) P國標(biāo)方法測定結(jié)果(mg*kg-1)扣背景測+j 定結(jié)果(mgkgT)酸牛乳”7140.好口0. 07小蓼牛乳隊(duì)72. %0.46“0. 10 酸牛乳時(shí)70. 6小0. 53-凱0. 14酸牛乳蟲72. 30. 6L0.1備京二.3結(jié)果與討論3.1牛乳與酸牛乳光譜圖比較國家標(biāo)準(zhǔn)GB2746-19992中規(guī)定酸牛乳中亞硝酸鹽的限量為W0.2mgkg-1,而按照國加 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法檢測，則均判定為陽性樣品，而在扣除背景干擾后，樣品檢測結(jié)果均合格。 國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法在檢測牛乳類樣品時(shí)，幾乎不存在干擾情況。圖3(圖中虛線為標(biāo)樣吸收 光譜圖，實(shí)線為樣品吸收光譜圖，下同)為牛乳樣品光譜圖與標(biāo)樣吸收

18、光譜圖比較，從圖中 可以看出，牛乳樣品的亞硝酸鹽樣品光譜圖和標(biāo)樣光譜圖基本一致，確認(rèn)其為亞硝酸鹽，然 后測定其峰高及吸光度值進(jìn)行定量計(jì)算。圖3牛乳樣品光譜圖酸牛乳加入各種輔料，比如食品添加劑，增稠劑，甜味劑等，經(jīng)過發(fā)酵以后，成分相對比牛 乳復(fù)雜的多，在經(jīng)過沉淀劑沉淀以后，濾液中含有沉淀不完全或粒徑較小的顆粒。而這些顆 粒在測定波長538nm處有吸收，從而干擾目標(biāo)組分的測定。圖4為酸牛乳樣品光譜圖，從圖中可以看出，由于干擾的存在，各個(gè)吸收峰疊加，分辨不出 亞硝酸的吸收峰。按照國標(biāo)方法，直接測定吸光度定量，則造成假陽性的情況。波長知1圖4酸牛乳樣品光譜圖3.2背景干擾及消除方法筆者經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究，認(rèn)為背景干擾主要來自濾液中雜質(zhì)組分和顆粒在538nm存在吸 收，干擾導(dǎo)致酸牛乳樣品吸收光譜變形，其背景干擾光譜圖如圖5所示。濾液中有雜質(zhì)組分 和小分子物質(zhì)，入射單色光就會(huì)因色散、反射而使透射光的強(qiáng)度減弱，檢測器所得到的吸光 度就會(huì)比實(shí)際的正確值偏大3；量子光學(xué)認(rèn)為，吸光粒子間的平均距離減小，受粒子間電 荷分布相互作用的影響，其摩爾吸收系數(shù)發(fā)生變化4。以上兩種情況導(dǎo)致偏離比爾定律。 而這種干擾往往是肉眼不可見的，常常在檢測中被忽略。0.0100.000波長Imn0.0400.030 -0.020 -3.00500.00550.0060G660.0C圖5