細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)集合

1、.實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配制及細(xì)胞培養(yǎng)的條件一、培養(yǎng)基的特性細(xì)胞生存的環(huán)境與條件1、溫度條件（ 37 0.5）2、pH 條件 （7.2-7.4）3、氣體條件4、水的質(zhì)量（三蒸）5、滲透壓6、營(yíng)養(yǎng)條件7、無(wú)菌條件二、培養(yǎng)基的分類1、平衡鹽液2、天然培養(yǎng)基（小牛血清、胚胎液）3、合成培養(yǎng)基（化學(xué)成分清楚）三、RPMI1640培養(yǎng)基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸鈉 .0.11 g電3、Hepes（羥乙基哌碃乙硫磺酸）5.925 g磁攪4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000 mL四、過濾出菌.儀器：不銹鋼正壓濾器材料：纖維素微孔慮膜（0.22 mm 孔徑）裝好后消毒五、完全培養(yǎng)基的配制R

2、PMI 1640 培養(yǎng)液85 mL小牛血清10 mL谷氨酰氨1 mL抗菌素（青、鏈霉素）1 萬(wàn)單位 1 mL實(shí)驗(yàn)二動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使之生存、生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞其結(jié)構(gòu)和功能接近體內(nèi)情況，便于使用各種技術(shù)和方法進(jìn)行研究，并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、 分化過程中的形態(tài)和功能變化，而且可同時(shí)提供大量生物學(xué)性狀相似的細(xì)胞作為研究對(duì)象。所以細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)非常重要的技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)不但是一門技術(shù)，也是一門科學(xué)，有它的基本理論、基本知識(shí)、和基本方法。一

3、、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.使學(xué)生在細(xì)胞培養(yǎng)方面得到一些初步的感性知識(shí)，了解動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過程；學(xué)習(xí)動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的基本方法，掌握動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的無(wú)菌操作技術(shù)，以及培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)分類特點(diǎn)；.以所培養(yǎng)細(xì)胞為材料， 了解細(xì)胞凍存的幾種簡(jiǎn)易方法并通過實(shí)驗(yàn)掌握其中的一種方法；以所培養(yǎng)細(xì)胞為材料，學(xué)習(xí)動(dòng)物細(xì)胞融合的幾種方法并掌握其中的一種方法。二、實(shí)驗(yàn)條件本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室完成。1、需要提供CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞融合儀，冷凍儀，研究用成像顯微鏡，體視成像顯微鏡，普通顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，全自動(dòng)高壓滅菌鍋，水浴鍋，超聲波清洗儀，超凈工作臺(tái)，真空泵，冷凍離心機(jī)，干燥箱，剪刀，鑷子，液氮罐，純水器，低溫冰

4、箱，普通冰箱等。2、各種規(guī)格培養(yǎng)瓶、離心管，吸水紙，各種試劑瓶，培養(yǎng)皿3、生化試劑 ：胰蛋白酶，膠元蛋白酶，M9 培養(yǎng)基， DMEM， RPMI1640 培養(yǎng)基， M199 培養(yǎng)基，牛尾膠元，肝素，秋水仙素，PHA，小牛血清，青霉素，鏈霉素，EDTA，HEPES， Hanks 液， Earl液，熒光染料，快綠，谷氨酰胺，聚乙二醇，4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 小白鼠，兔子三、實(shí)驗(yàn)要求1、根據(jù)細(xì)胞工程理論課所學(xué)知識(shí)，就以上實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方案（包括所選用材料、實(shí)驗(yàn)技術(shù)、方法）；2、實(shí)驗(yàn)方案須交指導(dǎo)教師修改，然后開始實(shí)驗(yàn)；3、實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，獨(dú)立完成。4、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案前要多查閱文獻(xiàn)資料，根據(jù)實(shí)際

5、情況來(lái)選材、設(shè)計(jì)，盡量做到就地取材。5、實(shí)驗(yàn)完成后，要認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)實(shí)驗(yàn)成敗的因素，寫出詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。四、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明1、本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下幾點(diǎn)：1.動(dòng)物組織細(xì)胞形態(tài)觀察與識(shí)別；2.動(dòng)物細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)； 3.動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)；4.動(dòng)物組織細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)；5.動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存； 6.動(dòng)物細(xì)胞的融合。2、要使細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，供給細(xì)胞存活所必須的條件，如：水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖、生長(zhǎng)因子等，還要受到溫度、滲透壓等多種因素的影響。細(xì).胞培養(yǎng)用品的清洗、培養(yǎng)用液的配制、除菌等均有嚴(yán)格的要求，特別是無(wú)菌操作，是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。3、直接從生物體內(nèi)獲

6、取細(xì)胞進(jìn)行首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要做再培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細(xì)胞分散后，以一定的比率從一個(gè)容器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，為傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)就是細(xì)胞代數(shù)。4、大多數(shù)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能貼附在支持物表面生長(zhǎng)，稱貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞，少數(shù)種類的細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不貼附在支持物表面，而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，稱為懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞。5、在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的傳代及日常維持工作需要大量的耗費(fèi)，而且隨著傳代次數(shù)的增加，體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物特性會(huì)慢慢發(fā)生變化，因此需要對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)的凍存，必要的時(shí)候在復(fù)蘇。6、兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞，成為細(xì)胞融合。五、注意事項(xiàng)1、每班成立一

7、個(gè)班長(zhǎng)負(fù)責(zé)制的開放實(shí)驗(yàn)管理小組，成員為每小組的組長(zhǎng)，負(fù)責(zé)安排相關(guān)同學(xué)配合教師完成以下工作：（1）實(shí)驗(yàn)前領(lǐng)取實(shí)驗(yàn)試劑和器具；（2）實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)室的水電、藥品安全、儀器使用和登記情況、清潔衛(wèi)生；（3 實(shí)驗(yàn)完成后整理實(shí)驗(yàn)室。2、實(shí)驗(yàn)過程中要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，獨(dú)立完成。做到愛護(hù)儀器、節(jié)約材料和藥品。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)清潔整理用過的實(shí)驗(yàn)儀器和用品。六、思考題1、簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件。2、在細(xì)胞培養(yǎng)中如何防止污染？3、為什么培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)？4、簡(jiǎn)述貼附型生長(zhǎng)細(xì)胞和懸浮型生長(zhǎng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)的主要方法和步驟。5、進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)要注意哪些問題？細(xì)胞融合率受哪些因素的影響？6、冷凍過程中為

8、什么要用慢速冷凍的方法？實(shí)驗(yàn)三動(dòng)物細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)（SP2/0 細(xì)胞）.一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、為細(xì)胞融合準(zhǔn)備SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞；2、雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)（種腹水），或傳代培養(yǎng)。二、實(shí)驗(yàn)原理：小鼠骨髓效力細(xì)胞株（ NSI，SP2/0）和雜交瘤細(xì)胞均具有無(wú)限生長(zhǎng)繁殖的能力，它們都屬于半貼壁細(xì)胞，不用胰蛋白酶或 EDTA 消化液，只需輕輕沖洗瓶壁上的細(xì)胞便可脫落。 因而可以利用這些特性對(duì)這類細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)， 以為實(shí)驗(yàn)提供生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞）。三、實(shí)驗(yàn)材料：SP2/0 細(xì)胞（或雜交瘤細(xì)胞）CO2 培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)瓶 （25、50、100 毫升）、彎頭滴管、 消毒用套筒（玻璃或銅

9、質(zhì)）、吸頭、 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基、倒置顯微鏡、試管架、酒精燈、滅菌高壓鍋。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、復(fù)蘇的或轉(zhuǎn)瓶的傳代細(xì)胞，使細(xì)胞濃度大約為5104/毫升，置 37 5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、培養(yǎng) 48 小時(shí)后，可見部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而部分細(xì)胞呈漂浮狀態(tài)，可用滴管吸去漂浮的細(xì)胞，加入少量新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)以上。3、若細(xì)胞生長(zhǎng)過密，則需及時(shí)沖下并吸出部分細(xì)胞，或?qū)⑽龅募?xì)胞轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，如果不是這樣處理， 細(xì)胞很易出現(xiàn)衰老、 死亡現(xiàn)象，對(duì)于雜交瘤來(lái)講，這樣更易誘發(fā)陽(yáng)性克隆丟失可能性。4、用于細(xì)胞融合的骨髓細(xì)胞， 必須在生長(zhǎng)繁殖的對(duì)數(shù)期 （約 105 細(xì)胞 /毫升），而且細(xì)胞形態(tài)

10、規(guī)則要一致（圓而亮，有一定的立體感），機(jī)能要活躍，活細(xì)胞數(shù)在 90 95%以上。要得到這種細(xì)胞，其培養(yǎng)技巧在于，在融合前 24 小時(shí)，將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞全部自瓶壁沖下來(lái)，并除去 1/2 或更多的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液令細(xì)胞重新貼壁分裂增繁。.5、作為長(zhǎng)期在體外傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，為減少工作量， 可采用 8 10%小牛血清的培養(yǎng)基，這樣細(xì)胞的繁殖速度亦慢，一般可間隔3 天更換一次培養(yǎng)液。6、本試驗(yàn)要求各組將細(xì)胞自小瓶轉(zhuǎn)入中瓶再轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)，并用對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞用于凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)（見實(shí)驗(yàn)六）。五、結(jié)果觀察：1、細(xì)胞傳代前后的生長(zhǎng)狀態(tài)及速度的觀察；2、細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶后生長(zhǎng)情況觀察；3、了解生長(zhǎng)良好，一般

11、及較差細(xì)胞的顯微鏡下觀察；4、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的體會(huì)。六、注意事項(xiàng)：1、連續(xù)細(xì)胞傳代培養(yǎng)更應(yīng)注意無(wú)菌操作；2、傳代時(shí)機(jī)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的狀況及速度十分重要，尤其要注意不能等細(xì)胞出現(xiàn)老化后再傳代，那樣做一般結(jié)果并不如愿；3、傳代轉(zhuǎn)瓶時(shí)細(xì)胞量的取舍主要根據(jù)細(xì)胞量的多少，生長(zhǎng)條件優(yōu)劣以及個(gè)人實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而決定；4、用于凍存、融合、傳代的細(xì)胞都要求是處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞，不能勉強(qiáng) 為之。實(shí)驗(yàn)四淋巴細(xì)胞雜交瘤的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、系統(tǒng)了解淋巴細(xì)胞雜交瘤實(shí)驗(yàn)技術(shù)的全部過程；2、學(xué)會(huì)觀察與判別融合細(xì)胞的出現(xiàn)，并計(jì)算融合率。二、實(shí)驗(yàn)原理：小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中生存并大量繁殖。經(jīng)過用某種抗原免疫的小鼠及淋巴細(xì)胞能分泌

12、某種抗體，但小鼠的B 淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌霜種抗體的B 淋巴細(xì)胞在融合因子（聚乙二醇， PEG）作用下產(chǎn)生融合，則融合的細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞易分裂增殖的特性，又具有 B 淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體的能力，在HAT 選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到.雜交細(xì)胞。這種融合的被稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤的細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)液中大量繁殖生長(zhǎng)，從培養(yǎng)液上清中可以收集到大量某 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)物單克隆抗體。三、實(shí)驗(yàn)材料：免疫的 BALB/ 小鼠， SP2/O 骨髓瘤細(xì)胞株， CO2 培養(yǎng)箱超凈工作臺(tái)倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡恒溫水箱計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、蓋玻片；離心機(jī)手提式自封消毒鍋彎頭滴管吸量管（ 1.

13、0、0、5.0 毫升）注射器（ 5 毫升， 10 毫升）針頭（ 7#）細(xì)胞培養(yǎng)瓶24 孔、 96 孔培養(yǎng)板（天津產(chǎn)或進(jìn)口）酒精燈目鋼絲網(wǎng)9cm 平皿50ml 帶蓋塑料離心管毫升三角瓶、青毒素小瓶燒杯（ 100，500，1000 毫升）微濾器 1000 毫升正壓不銹鋼濾器微孔濾膜眼科剪、鑷脫脂棉、紗布、膠布、衛(wèi)生卷紙HAT 培養(yǎng)基HT 培養(yǎng)基.無(wú)血清培養(yǎng)基15%小牛血清培養(yǎng)基小牛血清乙醇（ AR ，工業(yè)純）CPBS四、培養(yǎng)基與試劑的配制：1、RPMI-1640 培養(yǎng)基的配制；RPMI-1640 粉10.4g丙酮酸鈉0.11gHepes5.925g三蒸水1000ml磁力攪攔器攪攔 3 小時(shí)，溶解后

14、過濾除菌，在4中保存。2、200mML- 谷氨酰胺的配制：L-谷氨酰胺1.461g三蒸水100ml深解后，過濾除菌，分裝小瓶，每瓶1ml，在 -20保存。4.5%碳酸氫鈉（ NaHCO3）配制NaHCO35g三蒸水100ml8 磅高壓滅菌 15 分鐘，在 4保存。如分裝小瓶，每瓶4.2ml。5、次黃嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT） 100 倍母液配制：次黃嘌呤（ Hypoxanthine，H）102m68.05mg胞腺嘧啶核苷（ Thymidine,T ）1610-3m19.4mg三蒸水50ml.在 4550水浴中溶解，過濾除菌，分裝小試管中，每管 15ml，在 -20 保存。6、氨基碟呤（ A ）

15、 4 10-5m1.76mg三蒸水90mlIN 氫氧化鈉0.5ml溶解后，加入 IN 鹽酸 0.5ml 中和，補(bǔ)充蒸餾水至 100ml 過濾除菌，分裝小試管內(nèi)，每管 1 5ml，在 -20保存。7、無(wú)血清 RPMI-1640100mlL-谷氨酰胺 200nM（0.2）1.0ml抗菌素（青、鏈霉素各1 萬(wàn)單位）1.0ml5%碳酸氫鈉4.2ml8、RPMI-1640 完全培養(yǎng)基配制RPMI-1640 完全培養(yǎng)液100mlL-谷氨酰胺 200mM（0.2m）1.0ml青、鏈霉素（各 1 萬(wàn)單位 /ml ）1.0ml5%碳酸鈉4.2ml小牛血清（滅活）15ml9、HAT 培養(yǎng)基的配制：RPMI-164

16、0 完全培養(yǎng)基100ml100倍HT母液1.0ml100倍A母液0.8ml10、 HT 培養(yǎng)基的配制RPMI-1640 完全培養(yǎng)基100ml.100 倍 HT 母液1.0ml11、 50%（W/V ）聚乙二醇（ PEG）液的配制PEG10.0g8 磅 15 分鐘，或煮沸 20 分鐘滅菌并且融化，冷至50時(shí)加入。RPMI-1640 無(wú)血清培養(yǎng)基10ml混合均勻，分裝小試管內(nèi)，每管0.7ml，在 -4中保存。12、 0.15MPH7.2 枸櫞酸鈉 -PBS 配制：NaCI6.4gKCI0.16gNaHPO4 H2O2.32g240.16gKHPO枸櫞酸鈉7.6g二蒸水1000ml分裝在 100ml

17、 瓶中，每瓶 50100ml，8 磅 15 分鐘高壓滅菌后， 在 4保存。13、 20%二甲基亞礬（ DMSO ）細(xì)胞保存液的配制（按體積計(jì)算）：小胎牛血清5 份RPMI 完全培養(yǎng)基3 份二甲基亞礬（ DMAO ）2 份混勻，在 4保存，不必過濾除菌或高壓清毒二甲亞礬，因它也是有毒的以至于自身是無(wú)菌的。14、 8-氮鳥嘌呤 100 倍母液的配制8-氮鳥嘌呤 1152mg0.36%NaHCO21.0ml4NNaOH100ml三蒸水100ml.過濾除菌，分裝小瓶，每瓶1.0ml，在 -40保存。15、 0.1%伊文氏蘭液配制：伊文氏蘭液（ Fvengsblue）0.1g0.15M PH7.2 枸楷

18、酸鈉 -PBS100ml混勻， 4保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀釋成0.1%。五、實(shí)驗(yàn)步驟：1、取末次免疫后的第3 天小鼠脾細(xì)胞懸液，將108 小鼠脾細(xì)胞與 1-5107 SO2 /O 小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合于50 毫升刻度離心管中，經(jīng)1000 轉(zhuǎn)/分離心 7 分鐘；2、棄上清液，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀，離心管置 37水中進(jìn)行水?。ㄒ恍校瑴?zhǔn)備融合；3、將 37水浴中保溫的 50%PEG1.0 毫升（實(shí)際應(yīng)用 0.7 毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60 秒鐘內(nèi)滴完，在 37水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)；4、加完 PEG 后，將細(xì)胞

19、懸液放在 37水浴中靜置 90 秒鐘，立即在 24 分鐘內(nèi)加入 15 毫升無(wú)血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)基（ 37），開始要一滴一滴地加，由于稀釋使 PEG 停止作用。注意盡可能不攪動(dòng)細(xì)胞；5、再經(jīng) 100 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘。棄去上清液，加25 毫升 HAT 培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細(xì)胞的兩個(gè)24 孔培養(yǎng)板中，每孔0.5 毫升；6、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO2 孵箱中， 37孵育。 CO2 含量為 5%；7、每 23 天換一次 HAT 培養(yǎng)液，連續(xù) 2 周觀察雜交瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)。2周后使用 HT 培養(yǎng)基。六、注意事項(xiàng)：1、細(xì)胞雜交瘤的實(shí)驗(yàn)全過程必須是在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)

20、行，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的疏忽均可導(dǎo)致嚴(yán)重污染。因而須嚴(yán)格的無(wú)菌操作。2、試劑價(jià)格相對(duì)昂貴，應(yīng)注意節(jié)省。3、試驗(yàn)中的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是結(jié)細(xì)胞融合過程和細(xì)胞克隆的篩選工作更為重視。.實(shí)驗(yàn)五細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)有限稀釋法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆化培養(yǎng)技術(shù)；2、學(xué)會(huì)細(xì)胞克隆形成的辯觀察技能；3、配合抗體分泌細(xì)胞篩選技術(shù)，確定抗體分泌細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)原理：克隆化培養(yǎng)即單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)，可以及時(shí)確定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，同時(shí)淘汰因發(fā)生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現(xiàn)無(wú)抗體分泌陰性細(xì)胞株。一般雜交瘤細(xì)胞需經(jīng)過 523 次反復(fù)克隆后，才能達(dá)到 100%細(xì)胞陽(yáng)性

21、率。該辦法亦適用于一般細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞純化、 突變細(xì)胞株的選擇， 識(shí)別和分離。是細(xì)胞株的常用方法。三、實(shí)驗(yàn)材料：雜交瘤細(xì)胞、 25 毫升培養(yǎng)瓶、 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（天津有機(jī)玻璃廠）、移液管（ 1 毫升、 5 毫升、 10 毫升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、CO2 培養(yǎng)箱、白細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、蓋玻片、防水筆、 RPMI-1640、小牛血清、青鏈霉素、 10 毫升刻度離心管， 00 橡膠塞，飼養(yǎng)細(xì)胞（ 3-6 105/ml 、見腹腔細(xì)胞的制備）。四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、分裝了每孔 0.1 毫升腹腔細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（可提前24 小時(shí)準(zhǔn)備就緒，置 CO2 培養(yǎng)箱中備用）；2、自細(xì)胞培養(yǎng)瓶中收集長(zhǎng)勢(shì)良

22、好的雜交瘤細(xì)胞（亦可自24 孔培養(yǎng)板孔中收集），制成懸液。3、按白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確計(jì)得細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)，一般在105 /毫升左右。4、取 3 支 10 毫升刻度離心管排列在超凈工作臺(tái)試管架上，先用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至103/毫升，再用含 15%小牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋到101/毫升細(xì)胞，即每 0.1 毫升 1 個(gè)細(xì)胞。5、每孔 0.1 毫升細(xì)胞懸液。6、置 375%CO2 培養(yǎng)箱， 4 天后取出觀察，并在板蓋上打上標(biāo)記，做好記錄并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。.7、繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，則在第4-5 天更換 1/2 培養(yǎng)基，約第 7-9 天可以收獲培養(yǎng)液上清用于檢測(cè)抗體。并重復(fù)檢測(cè)1-2 次。8、選擇單克隆生長(zhǎng)孔，生長(zhǎng)

23、良好，陽(yáng)性強(qiáng)者，轉(zhuǎn)移到24 孔板再做克隆經(jīng)培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以總細(xì)胞孔（如96 孔）中出現(xiàn)克隆孔統(tǒng)計(jì)出克隆百分率，并可進(jìn)一步按單細(xì)胞孔、雙細(xì)胞孔、多細(xì)胞孔分別計(jì)算出百分率。六、注意事項(xiàng)：1、注意無(wú)菌操作，一旦發(fā)現(xiàn)污染（孔）必須及時(shí)處理；2、計(jì)數(shù)細(xì)胞要求準(zhǔn)確，稀釋量亦要準(zhǔn)確，否則將造成一孔多細(xì)胞克隆或克隆百分離太低；3、在計(jì)數(shù)克隆出現(xiàn)率之前，不宜更換培養(yǎng)液，也不宜強(qiáng)烈振動(dòng)培養(yǎng)板；4、做克隆化培養(yǎng)的小牛血清必須是優(yōu)質(zhì)血清；5、若做克隆抗體檢測(cè)時(shí)，特別要保護(hù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，防止細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至丟失。七、說(shuō)明：哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過分離、稀釋接種，培養(yǎng)在適宜于單細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中，形成細(xì)

24、胞克隆。 運(yùn)用這項(xiàng)技術(shù)可以制作細(xì)胞成活曲線，即在接種相同數(shù)量細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，加入不同濃度的化學(xué)藥品， 或照以不同劑量的射線， 觀察其對(duì)細(xì)胞的聽見害程度。由此可以在哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行誘變?cè)囼?yàn)及分離突變細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)六雜交瘤細(xì)胞的冷凍保存和復(fù)蘇技術(shù)一、目的：掌握凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的技術(shù)雜交瘤細(xì)胞株一經(jīng)建立應(yīng)盡快凍存，以保證雜交瘤細(xì)胞不至于因傳代污染或因變異而丟失， 在克隆化前將抗體陽(yáng)性的樣本凍存，在一旦克隆傳代失敗或在增殖過程中丟失， 還可將保存的雜交瘤細(xì)胞重新復(fù)蘇，繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 將細(xì)胞凍存還可避免繁重的細(xì)胞傳代工作量以及不明原因的污染和細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的變異。.用于細(xì)胞融合的骨髓細(xì)胞株也可同樣方法保存：

25、以取得穩(wěn)定可靠的親本細(xì)胞來(lái)源。因此，冷凍保存細(xì)胞株是雜交瘤研究的一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。該技術(shù)同樣適用于一般動(dòng)物細(xì)胞的冷凍和保存。二、原理：主要是城保護(hù)下，降低保存溫度甚至用深低溫（ 196）保存，借以減低或幾乎停止細(xì)胞的活力的能量產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，從而延長(zhǎng)保存期。冷凍保護(hù)劑有許多種類，而較普遍采用的是二甲基亞礬（ Demathy,Sulfoxid e,DMSO）它的作用既能降低細(xì)胞的新陳代謝，又能維護(hù)細(xì)胞膜的強(qiáng)度，使水分不易進(jìn)入細(xì)胞而影響其冷凍保存。三、試劑、器材：1640 完全培養(yǎng)基， 10%DMSO-1640 完全培養(yǎng)基，無(wú)血清1640 培養(yǎng)基。恒溫水浴、液氮罐、玻璃安瓶或帶密封蓋的塑料小管，裝安瓶

26、的小布袋，刻度離心管，膠塞、培養(yǎng)或小培養(yǎng)瓶、小燒杯、細(xì)胞計(jì)數(shù)用器材。四、操作方法：1、細(xì)胞懸液配制：取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好的待凍存細(xì)胞，用離心法收集細(xì)胞，并用凍存培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至 3-5106/ml 。2、分裝：將細(xì)胞懸液注入2ml 安瓶中或塑冷凍管中，每支0.51.0ml，封緊（安瓶用火焰封口），每只安瓶上標(biāo)上細(xì)胞名稱、凍存日期、裝入小布袋中。3、緩慢降溫，原則上要使凍存細(xì)胞瓶的溫度每分鐘下降1，待降至 -60-70時(shí)，再將細(xì)胞浸沒有液氮中，各實(shí)驗(yàn)室的操作方法根據(jù)細(xì)胞的種類和經(jīng)驗(yàn)略有不同，以下兩法均可使用。將細(xì)胞管先放置4或普通冰箱冰格內(nèi)2 小時(shí)，再移至液氮容器面上， 停留 30 分鐘后（約

27、-60-70），再浸入液氮中。將細(xì)胞瓶放入壁厚12cm 的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在 80冰箱中過夜，次日將細(xì)胞瓶移至液氮中。亦有人將安瓶放在4冰箱中 4 小時(shí)，再置安瓶于氣態(tài)氮中20 分鐘，然后立即放入液態(tài)氮中。.五、細(xì)胞復(fù)蘇：1、從液氮罐中取出安瓶或其它類型塑料冷凍管，有時(shí)冷凍管因未封嚴(yán)，浸入液氮后，取出后安瓶或管子內(nèi)液迅速氣化可以爆炸（力量有限） 因此應(yīng)戴手套和防護(hù)眼鏡。2、迅速放入裝有 37-40的熱水燒杯中（放在超凈工作臺(tái)內(nèi)），用鑷子夾緊并不時(shí)搖動(dòng)，令盡快融化。3、如用安瓶冷存，取出后，用70酒精擦試消毒后。折斷頸部，如用塑料管，則防止融融時(shí)滲入水，打開蓋子，用吸管吸出

28、懸液，注入離心管中，再補(bǔ)加10 毫升培養(yǎng)液（滴加）；或直接滴入裝有 10ml 培養(yǎng)液中（可以用無(wú)血清培養(yǎng)液） 。4、低速離心（ 1000 轉(zhuǎn)/分） 5-7 分鐘，去上清，一般不再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。5、用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶中或24 孔培養(yǎng)板中 375%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。6、以后仍按常規(guī)傳代培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：1、安瓶或管內(nèi)凍存的細(xì)胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10-1： 20 的稀釋，最后細(xì)胞數(shù)量 /毫升仍要比一般高一些，一般再培養(yǎng)接種濃度為5104/毫升，因此凍存細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到107 毫升，在融后稀釋20 倍后，仍能保持5 105/毫升數(shù)

29、量。2、加入一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞有助于復(fù)蘇細(xì)胞成活，飼養(yǎng)細(xì)胞的密度一般105/毫升左右。3、一般復(fù)蘇細(xì)胞的成活率在2070%左右。參考資料：章谷生等主編： 單克隆抗體醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用上海科學(xué)技術(shù)出版社1987.4柏乃慶編著 人體保存（細(xì)胞、組織和器官的保存技術(shù)） 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社 1985.3張和君等編譯單在隆抗體及細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)云南科學(xué)技術(shù)出版社1986.12.劉祖洞等編遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)（第二版）高教出版社1987.11實(shí)驗(yàn)七流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備流式細(xì)胞儀 (FCM) 是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、 激光、計(jì)算機(jī)等高技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種先進(jìn)儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測(cè)人白細(xì)胞表面標(biāo)志可對(duì)白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對(duì)淋巴細(xì)胞群和亞群進(jìn)行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細(xì)胞?；罴?xì)胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM 檢測(cè)的標(biāo)本準(zhǔn)備，染色