免疫沉淀試驗(yàn)

1、關(guān)于免疫沉淀試驗(yàn)第一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 教 學(xué) 目 的掌握：液相內(nèi)沉淀試驗(yàn)、凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)原理熟悉：沉淀反應(yīng)的特點(diǎn)、免疫電泳技術(shù)、沉淀反應(yīng)的應(yīng)用第二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、基本原理免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié) 免疫沉淀試驗(yàn)的基本原理第三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個(gè)階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見第四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月環(huán)狀沉淀試驗(yàn)絮狀

2、沉淀試驗(yàn)免疫濁度測(cè)定免疫擴(kuò)散試驗(yàn)免疫電泳技術(shù)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)二、免疫沉淀試驗(yàn)的分類第五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 階段性2. 特異性3. 抗原性質(zhì)：可溶性4. 抗體的選擇：2價(jià) 三、 免疫沉淀試驗(yàn)的特點(diǎn)第六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 液體免疫沉淀試驗(yàn)第七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)絮狀免疫沉淀試驗(yàn)是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。第二節(jié) 液體免疫沉淀試驗(yàn)第八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：

3、抗原抗體最適比例一、絮狀免疫沉淀試驗(yàn)第九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖 混勻、37孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg第十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月最適比方陣測(cè)定法第十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 原理： 當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在增濁劑中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。 二、免疫濁度測(cè)定第十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu) 點(diǎn)：穩(wěn)定性好、簡便快速，易于

4、自動(dòng)化敏感度高精確度高無放射性核素污染第十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.根據(jù)反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分為 速率比濁法 終點(diǎn)比濁法 2.根據(jù)檢測(cè)儀器的位置及光信號(hào)性質(zhì)分為 透射免疫比濁法 散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分 類：第十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 透射比濁試驗(yàn)和散射比濁試驗(yàn)光路檢測(cè)器A檢測(cè)器B IC I0 I I 透射比濁試驗(yàn) 散射比濁試驗(yàn)當(dāng)復(fù)合物3106dal，II;90，散射光的量代表IC的量。第十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）抗原抗體的比例：反應(yīng)體系保持抗體過量（2）抗體的質(zhì)量 ：特異性強(qiáng)，效價(jià)高，親和力強(qiáng)，并使用R型

5、抗體 （3）抗原抗體反應(yīng)液的環(huán)境：最適PH為6.5-8.5 （4）增濁劑補(bǔ)充：免疫濁度測(cè)定影響因素第十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）抗原抗體的比例第十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 在抗體過量的反應(yīng)體系中,抗原量的遞增與比濁定量成正比,當(dāng)抗原抗體比例合適時(shí)反應(yīng)達(dá)峰值,而當(dāng)抗原過量時(shí),形成的免疫復(fù)合物分子小,濁度反而下降的一個(gè)拋物曲線。海德堡曲線第十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）抗體的質(zhì)量抗體的特異性抗體的效價(jià)(1:20)抗體的親和力R型和H型抗體（R型）第十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為：6.

6、5-8.5離子強(qiáng)度大，IC形成快離子種類的影響，常用磷酸鹽緩沖液（4）增濁劑PEG(60008000) 濃度4%吐溫-20第二十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.抗血清中有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分2.增濁劑濃度和反應(yīng)時(shí)間掌握不當(dāng)3.樣品本身的濁度處理不當(dāng)4.試劑污染變質(zhì)5.比色杯不夠清潔 偽濁度形成的原因第二十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第二十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)第二十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比

7、例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 原理第二十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)介質(zhì)：凝膠凝膠的特點(diǎn)：1、固相的液體2、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3、Ag-Ab復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)在凝膠中第二十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：抗體與待測(cè)的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點(diǎn)：1.制板2.打孔3.加樣4.擴(kuò)散 5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量試驗(yàn)一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 第二十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán) 一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第二十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022

8、年6月第二十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月T1為16-24h；T2為24-48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線第二十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月待檢蛋白質(zhì)抗原須具備的條件僅針對(duì)某待測(cè)抗原的單價(jià)特異性抗血清已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)品含量在1.25g/ml以上第三十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月單向擴(kuò)散試驗(yàn)上排為5個(gè)不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清一、單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)

9、作于2022年6月應(yīng) 用IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白的檢測(cè)第三十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)要點(diǎn)： 1.制板 2.打孔 3.加樣 4.擴(kuò)散二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 第三十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.判斷抗原或抗體的存在以及估計(jì)相對(duì)含量2.分析抗原或抗體相對(duì)分子量 二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)第三十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3.分析抗原的性質(zhì)二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 第三十七張，PPT共七十八頁，

10、創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4.滴定抗體的效價(jià)5.鑒定抗原或抗體純度 二、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 第三十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 應(yīng) 用 1.AFP檢測(cè)的最早方法 2.血清中含量較高的酶類、細(xì)菌病毒感染后血清中產(chǎn)生的抗體的檢測(cè)第四十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、免疫電泳技術(shù)第四十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 優(yōu)點(diǎn)： 1.加快反應(yīng)的速度。 2.提高了靈敏度。3.增加了分辨率。 電泳分析沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量三、免疫電泳技術(shù)第四十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6

11、月電泳（electrophoresis） ：在外加電場(chǎng)的作用下帶電顆粒向著其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。 第四十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳遷移率： 定義：同一電場(chǎng)條件下，各種帶電粒子在 單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離。M=cm2/VS影響泳動(dòng)的速度的因素: 本身凈電荷量、顆粒大小、形狀 電場(chǎng)強(qiáng)度 溶液pH值 溶液離子強(qiáng)度 電 滲 第四十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電滲： 電場(chǎng)中液體相對(duì)于固體的運(yùn)動(dòng) 載體的性質(zhì) 緩沖液的離子強(qiáng)度 電泳時(shí)的電壓第四十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電滲方向與樣品運(yùn)動(dòng)方向一致： 樣品遷移率加快 電滲方向與樣品運(yùn)動(dòng)方向不一致：

12、 樣品遷移率降低，甚至倒退 第四十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳載體： 瓊脂 瓊脂糖凝膠 常用濃度：0.8%-1.0% 特點(diǎn):雜質(zhì)少、接近電中性，常溫易凝固，色澤透明、質(zhì)地均勻、富有彈性。第四十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)： -NH2 + H2O -NH3+ + OH- -COOH -COO- +H+ 兩性離子pH=pI 電中性，無電泳移動(dòng)性pHpI 堿性溶液 帶負(fù)離子，向陽極泳動(dòng)第四十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：雙向擴(kuò)散+電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù) 比雙向擴(kuò)散試驗(yàn)靈敏度提高816倍（一）對(duì)流免疫電泳第四十

13、九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月通電蛋白質(zhì)抗原常帶較強(qiáng)的負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動(dòng) （一）對(duì)流免疫電泳第五十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。（一）對(duì)流免疫電泳第五十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)評(píng)價(jià)： 1.簡便、快速,敏感度較雙擴(kuò)提高8-16倍，可測(cè)蛋白質(zhì)濃度達(dá) ug/ml. 2.要求抗原、抗體比例嚴(yán)格3.不適宜抗原抗體都是球蛋白的檢測(cè) 第五十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2

14、022年6月 抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時(shí)，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。 單向免疫擴(kuò)散電泳,定量檢測(cè)技術(shù)（二）火箭免疫電泳第五十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測(cè)樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測(cè)樣品濃度。技術(shù)要點(diǎn)（二）火箭免疫電泳第五十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月火箭免疫電泳圖為標(biāo)準(zhǔn)抗原；為標(biāo)本-+（二）火箭免疫電泳示意圖第五十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)果判定： 1、定性：直

15、接觀察、染色 2、定量：根據(jù)峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算3、為提高靈敏度，可加入少量125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰第五十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：區(qū)帶電泳雙向擴(kuò)散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶 2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進(jìn)行雙向擴(kuò)散 （三）免疫電泳第五十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)各蛋白所處的電泳位置,可分為:白蛋白區(qū)、球蛋白區(qū)、1區(qū)、2區(qū)、區(qū)、區(qū) + -ALB 1 2 白蛋白 抗胰蛋白酶 觸珠蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 IgG前白蛋白 酸糖蛋白 銅藍(lán)蛋白 C3aC3b CRP1脂蛋

16、白 抗糜蛋白酶 巨球蛋白第五十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.純化抗原和抗體成分的分析2.正常及異常免疫球蛋白的識(shí)別與鑒定應(yīng)用免 疫 電 泳第六十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月-+（三）免疫電泳示意圖第六十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)評(píng)價(jià)： 1.分辨率較高 2.僅定性 3.擴(kuò)散時(shí)間長，影響因素多，結(jié)果較難分析4.目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識(shí)別與鑒定。第六十五張，PP

17、T共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對(duì)各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型 原理區(qū)帶電泳沉淀反應(yīng)（四）免疫固定電泳第六十六張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月左圖為IgG 型, 中圖為IgG 型，右為正常 SPGAM SPGAM SPGAM （四）免疫固定電泳示意圖第六十七張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月原理： 待檢蛋白電泳 固定劑及各類抗血清加于凝膠表面的泳道 抗原與對(duì)應(yīng)抗體反應(yīng) 沉淀 漂洗 染色 某一抗原的存在? 第六十八張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月分辨率強(qiáng)，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時(shí)，

18、結(jié)果易于分析。 應(yīng)用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測(cè)與、分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測(cè)與分型。優(yōu)點(diǎn)（四）免 疫 固 定 電 泳第六十九張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用:M 蛋白的鑒定和分型第七十張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）交叉免疫電泳（六）自動(dòng)化免疫電泳第七十一張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 免疫沉淀試驗(yàn)的臨床應(yīng)用免疫濁度法：蛋白質(zhì)的檢測(cè)如免疫球蛋白、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子、C反應(yīng)蛋白等第七十二張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 臨床常用免疫沉淀試驗(yàn)試劑方法特點(diǎn)一、膠乳增強(qiáng)的透射免疫比濁試驗(yàn)在全自動(dòng)生化分析儀中的應(yīng)用二、膠乳增強(qiáng)的透射免疫比濁試驗(yàn)在血凝固分析儀中的應(yīng)用三、免疫固定電泳在半自動(dòng)電泳儀中的應(yīng)用四、散射免疫比濁試驗(yàn)在特種蛋白免疫分析儀中的應(yīng)用第七十三張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 影響免疫沉淀試驗(yàn)的主要因素如溫度、電解質(zhì)、酸堿度等第七十四張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月名詞: 沉淀反應(yīng)簡答: 1.雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的應(yīng)用2.免疫電泳技術(shù)的類型思 考 題第七十五張，PPT共七十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.根據(jù)海德堡曲線理論，下列說法不正確的是A 抗原