基因工程和蛋白質(zhì)工程課件

1、第十六章基因工程與蛋白質(zhì)工程 第一節(jié) 生物工程概述 第二節(jié) 基因工程 第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程第一節(jié) 生物工程概述一、生物工程概念及研究技術(shù)二、在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應(yīng)用一、生物工程的概念及研究技術(shù)1.基因工程在分子水平的遺傳操作技術(shù)2.細(xì)胞工程遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移4.生化工程生物工程產(chǎn)品的最終取得手段3.酶工程酶的改造和設(shè)計(jì)基因工程是指在微觀領(lǐng)域（分子水平）中，根據(jù)分子生物學(xué)和遺傳學(xué)原理，設(shè)計(jì)并實(shí)施一項(xiàng)把一個(gè)生物體中有用的目的DNA(遺傳信息)轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的需要的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物，最終實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的商業(yè)價(jià)值?；蚬こ袒蚬こ膛c建筑工程基因工程操作水平：DNA分子水平

2、目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得基因產(chǎn)物。2、基因工程的理論基礎(chǔ)1）物質(zhì)基礎(chǔ)脫氧核苷酸2）結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)3）中心法則，共用一套遺傳密碼細(xì)胞工程1、細(xì)胞工程的概念利用細(xì)胞融合技術(shù)把含有不同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞合成雜種細(xì)胞。并使之分裂生長(zhǎng)成為雜種生物。它包括體細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞器攝取和染色體片段的重組等。 細(xì)胞工程操作水平：細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品。2、細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)細(xì)胞全能性依據(jù)生物體的每一個(gè)干細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。異種植物細(xì)胞雜種細(xì)胞轉(zhuǎn)基因植物異種動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞群重組細(xì)胞體細(xì)胞細(xì)胞核早期胚胎受精卵去核卵細(xì)胞克隆動(dòng)物試管嬰兒動(dòng)物細(xì)胞

3、融合植物體細(xì)胞雜交植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)核移植胚胎移植體外受精3、主要技術(shù)植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體技術(shù)胚胎移植核移植植物細(xì)胞工程技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)酶工程酶工程是利用酶的特異催化功能，在常溫長(zhǎng)壓下將一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化為另一種物質(zhì)，以獲得高純度的適用之物。該技術(shù)包括各種酶的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。酶的分離和純化技術(shù)等。 酶工程用于食品工業(yè)很有效。啤酒、醬油、葡萄糖等都可用酶工程生產(chǎn)。二、生物工程在現(xiàn)代工、農(nóng)、醫(yī)領(lǐng)域中的應(yīng)用1.化工及冶金工業(yè)2.輕工和食品工業(yè)4.農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)3.醫(yī)藥工業(yè)5.環(huán)保和能源工業(yè) 稀少珍貴的蛋白質(zhì)藥物1982年，美國(guó)食品與藥物管理局批準(zhǔn)了首例基因工程產(chǎn)

4、品人胰島素投放市場(chǎng)它標(biāo)志了基因工程產(chǎn)品正式進(jìn)入到商業(yè)化階段。人生長(zhǎng)激素、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、a-干擾素、纖維素酶、抗血友病因子、紅細(xì)胞生成素、尿激酶原、白細(xì)胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等 畜牧業(yè)中的應(yīng)用動(dòng)物疫苗、生長(zhǎng)激素等例：從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA（組織溶解酶原激活劑）。 種植業(yè)中的應(yīng)用用攜帶外源基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，使外源DNA與植物染色體DNA整合，通過(guò)原生質(zhì)體的培養(yǎng)分化成愈傷組織，最后發(fā)育成具有新性狀的完整植株轉(zhuǎn)基因植物 基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造的技術(shù)。本節(jié)主要介紹DNA重組技術(shù)，大體上包括下列5個(gè)步驟

5、?；蚬こ淌?973年由美國(guó)斯坦福大學(xué)科恩和舊金山大學(xué)醫(yī)學(xué)院的博耶創(chuàng)立的概念第二節(jié) 基因工程DNA重組的 技術(shù)路線Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制備2、載體的構(gòu)建3、目的基因與載體的重組4、重組 體導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增5

6、、克隆基因的鑒定一、目的基因的獲得二、基因載體三、重組DNA的篩選及表達(dá)一、目的基因的獲得1.限制酶特異性切割DNA的手術(shù)刀2.取得目的基因的方法分離法及合成法1. 限制性內(nèi)切酶 DNA重組即是將兩種DNA分子經(jīng)過(guò)切割，選擇適合的片段連接起來(lái)的過(guò)程 實(shí)現(xiàn)這一步，是在限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)以后才實(shí)現(xiàn)的 限制性內(nèi)切酶：一類核酸內(nèi)切酶，可以將外源DNA在特定位點(diǎn)切割降解 。以后從細(xì)菌中分別分離出了I型和型兩類限制性內(nèi)切酶。 限制性內(nèi)切酶的命名 用細(xì)菌同名的第一個(gè)字母（大寫(xiě)）和種名的前兩個(gè)字母（小寫(xiě)）構(gòu)成酶的基本名稱。若酶是從其中一種特殊菌株來(lái)，還在基本名稱后加上菌株名稱符號(hào)。名稱后的羅馬數(shù)字，表示在該特殊

7、菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后次序。如HaeII是從（Haemophilus aegypticus）中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)酶。限制性內(nèi)切酶切割DNA的方式 a.從識(shí)別序列的中間切開(kāi)b.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的左右兩方進(jìn)行切割 c.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的右邊（5-3鏈）和對(duì)稱軸左邊（3-5鏈）切開(kāi) a.從識(shí)別序列的中間切開(kāi) 從識(shí)別序列的中間切開(kāi)產(chǎn)生平齊末端（bluntends）， 如Hae b.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的左右兩方進(jìn)行切割 即分別在5-3鏈和3-5鏈對(duì)稱軸的左右方切開(kāi) ，形成帶有凸出的5磷酸基團(tuán)的粘性末端（Cohesive ends），如EcoR c.在識(shí)別序列對(duì)稱軸的右邊（5-3鏈）和對(duì)稱軸左邊（

8、3-5鏈）切開(kāi)形成帶有凸出的3羥基的粘性末端，如pstI2.取得目的基因的方法 分離法及合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌體或質(zhì)粒直接從宿主細(xì)胞中將目 的基因攜出（3）使用相應(yīng)的mRNA分離基因二、基因載體1.質(zhì)粒染色體以外的遺傳單元2.噬菌體感染細(xì)菌的病毒 質(zhì)粒是一種環(huán)狀雙鏈的DNA分子。自身在細(xì)菌細(xì)胞中能不斷復(fù)制繁殖。研究比較深入的質(zhì)粒有大腸桿菌的性因子（F因子）、大腸桿菌素因子和抗藥因子等 抗藥因子（質(zhì)粒）在其DNA上編碼有某些酶的基因，表達(dá)產(chǎn)生的酶對(duì)鏈霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等藥物能產(chǎn)生生物化學(xué)修飾，使之鈍化而失效1.質(zhì)粒染色體以外的遺傳單元質(zhì)粒的作用 質(zhì)

9、粒DNA能從細(xì)菌中提出來(lái)，又能再轉(zhuǎn)入細(xì)菌。這個(gè)過(guò)程稱轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA仍能進(jìn)行復(fù)制，這種性能為DNA重組技術(shù)提供了重要的條件，即將一種外源基因與質(zhì)粒重組后，再轉(zhuǎn)入細(xì)菌中去復(fù)制繁殖，使外源基因得以增殖。 質(zhì)粒自身的某些抗藥基因成為從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中篩選它們的一種標(biāo)記。除質(zhì)粒外，噬菌體、病毒也能通過(guò)“感染”將外源基因帶入細(xì)菌并進(jìn)行復(fù)制。 目前所使用的質(zhì)粒 目前實(shí)驗(yàn)中所使用的質(zhì)粒、噬菌體和病毒載體種類很多。但都是經(jīng)過(guò)了人工改造，更適宜運(yùn)用于DNA重組技術(shù)。它們既保留了轉(zhuǎn)化和感染活細(xì)胞的能力，又具有多處攜帶外源DNA的酶切位點(diǎn)，并含有特殊的篩選標(biāo)記 這些載體中有些只能復(fù)制擴(kuò)增帶入的外源基因；有些可以使

10、外源基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯出基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，這種載體稱為表達(dá)載體pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 以噬菌體或病毒為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 我們常常采用噬菌體作為基因工程的載體，其一它的遺傳結(jié)構(gòu)與功能知道得比較清楚；其二是易于使細(xì)胞感染，易于使外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。2.噬菌體感染細(xì)菌的病毒以噬菌體為載體進(jìn)行DNA克隆DNA用限制性內(nèi)切酶除去中間一段與外源DNA連接重組載體的體外包裝帶有外源DNA的噬菌體太小不能被包裝頭部前體多聯(lián)體DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行DNA的裝配過(guò)程三、重組DNA的篩選及表達(dá)1.轉(zhuǎn)化帶有目的基因的載體進(jìn)

11、入受體細(xì)胞2.篩選從大量受體細(xì)胞選出帶有重組體的細(xì)胞3.表達(dá)外源DNA在受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯1.轉(zhuǎn)化帶有目的基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞 由質(zhì)粒作載體形成的克隆，轉(zhuǎn)入細(xì)菌時(shí)細(xì)菌預(yù)先要在低溫條件下用氯化鈣處理，形成“感受態(tài)”細(xì)胞。即增加細(xì)胞膜的通透性才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 由噬菌體作載體的克隆，轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過(guò)程稱為“侵染”。因噬菌體具有自動(dòng)侵入的功能。細(xì)菌不用預(yù)先處理。 噬菌體感染大腸桿菌的途徑2.篩選從大量受體細(xì)胞選出帶有重組體 的細(xì)胞（1）插入失活法（2）放射性探針檢測(cè)法（3）R-環(huán)檢測(cè)法（4）免疫測(cè)定法（1）插入失活法 在現(xiàn)在的基因工程操作中，所使用的載體通常是經(jīng)過(guò)加工改造的衍生物，它們要么帶有一個(gè)或幾個(gè)

12、可供選擇的遺傳標(biāo)記，要么具有被選擇的遺傳功能，這就使帶有目的基因與不帶目的基因的細(xì)菌有明顯區(qū)別，便于篩選。pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu) 如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活（2）放射性探針檢測(cè)法 利用mRNA可與相應(yīng)的DNA段落雜交，來(lái)檢測(cè)有外源DNA插入的重組體，是一種快速而靈敏的方法。（3）R-環(huán)檢測(cè)法 在有利于形成R-環(huán)的條件下，使待檢測(cè)的純化的質(zhì)粒DNA，在含有mRNA的緩沖液中局部變性。如若質(zhì)粒DNA存在著與mRNA探針互補(bǔ)的序列，mRNA就會(huì)取代DNA中一條鏈，與另一條鏈形成雙鏈雜交分子，從而形成R-環(huán)結(jié)構(gòu)，在電子顯微鏡下觀察，可直接觀察到R-

13、環(huán)。這樣可檢出重組體質(zhì)粒DNA。（4）免疫測(cè)定法免疫法測(cè)定只能是所轉(zhuǎn)移外源DNA必須表達(dá)后才能進(jìn)行，而且必須具備有效的特異性抗體。Southern和Western印跡法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled s

14、pesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiography3.表達(dá)外源DNA在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯 帶有目的基因的載體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞成功并篩選出來(lái)后，最終目的是要目的基因在受體細(xì)胞中得以表達(dá)，產(chǎn)生具有功能性的蛋白質(zhì)或肽。 第三節(jié) 蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程的概念二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)三、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用一、蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程(protein engineering)：通過(guò)改造與蛋白質(zhì)相應(yīng)的基因中的堿基順序，或設(shè)計(jì)合成新的基因，將它克

15、隆至受體細(xì)胞中，通過(guò)基因表達(dá)而獲得具有新的特性的蛋白質(zhì)技術(shù)1、基因定點(diǎn)突變定做新蛋白質(zhì)2、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)對(duì)天然蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)工程 舉例：定點(diǎn)突變技術(shù)： 已知絲氨酸是由TCT編碼，只要把C改為G，就變成半胱氨酸的密碼TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均與基因部分互補(bǔ)。打開(kāi)含有被突變蛋白質(zhì)基因的質(zhì)粒的雙條鏈成單鏈模板，用引物與之互補(bǔ)鏈退火（假如退火在適宜溫度下進(jìn)行，約15個(gè)堿基中，有一個(gè)堿基錯(cuò)配是可以容忍的）。然后由DNA聚合酶延伸引物，由DNA連接酶將雙鏈再連接成環(huán)，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞復(fù)制，即產(chǎn)生兩種子代質(zhì)粒。一半的順序中含有TCT順序，另一半含有TGT順序。表達(dá)具有TGT順序的質(zhì)粒，即可以產(chǎn)生在同一部位上半胱氨酸代替絲氨酸的蛋白質(zhì)。 二、蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)1、蛋白質(zhì)工程的