《生物制藥》課程實驗大綱講解學習

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。生物制藥課程實驗大綱-生物制藥課程實驗大綱編號：1300901課程名稱：生物技術制藥英文名稱：BiologicalPharmaceuticalTechnology實驗指導書名稱：生物制藥實驗指導書一、學時學分總學時：32學分：2實驗學時：8二、實驗目的本課程實驗的目的是使學生掌握生物技術制藥中的基因工程制藥、抗體制藥、細胞工程制藥、酶工程制藥、微生物工程制藥的基本原理、主要方法和技術，從而使學生能夠將理性知識與感性認識有機地結合起來，在實驗中更深地理解基礎理論，提高學生的綜合能力與創(chuàng)新意識以及分析問題和

2、解決問題的能力。同時通過實驗，培養(yǎng)學生觀察、思考、分析問題和解決問題的能力，實事求是，嚴肅認真的科學態(tài)度，以及勤儉節(jié)約、愛護公物的良好作風。三、實驗基本原理純培養(yǎng)技術、無菌操作技術、分子生物學基本原理及技術、免疫學原理及技術、細胞工程原理及技術、蛋白質工程原理。四、實驗基本要求在實驗內容的安排上，注意使學生加深對生物制藥工藝基本理論的理解。實驗的難易程度適中，嚴謹全面。根據(jù)實驗指導書完成課內實驗任務，客觀認真填寫實驗數(shù)據(jù)并進行結果分析、每次實驗及時上交實驗報告。五、考核與報告實驗考核以平時實驗預習報告、實驗態(tài)度、實驗操作及實驗處理幾部分組成，占該門課程成績30，實驗報告按實驗指導書提供的統(tǒng)一格

3、式進行書寫。六、主要儀器設備CO2培養(yǎng)箱、20W紫外燈、紅燈、血球記數(shù)板、攪拌器、高速冷凍離心機、冷凍干燥箱、真空干燥箱、高壓滅菌裝置、超凈工作臺、倒置顯微鏡、冰箱、液氮罐、精密天平、微量加樣器、烤箱、細菌過濾器、10L氣升式發(fā)酵罐、搖床、顯微鏡（帶油鏡）、紫外及可見光分光光度計、電泳儀、pH計等。七、實驗項目與內容提要序號實驗名稱內容提要每組人數(shù)實驗時數(shù)實驗要求實驗類別備注01甲甲殼質、殼聚糖的制備采用蝦殼做原料，制備甲殼質和殼聚糖34選開驗證02液體深層發(fā)酵生產抗生素學習微生物制藥的液體深層發(fā)酵技術，掌握抗生素效價的檢測及發(fā)酵產物的鑒定34選開綜合03抗生素的分離和鑒定（薄層層析法）采用薄

4、層層析法分離各種抗生素（如鏈霉素、卡那霉素等），以枯草芽孢桿菌作為生物顯影菌株確定斑點位置，求得Rf值，進行鑒定。34必開綜合04植物細胞/組織培養(yǎng)與細胞活性鑒定采用無菌操作的方法，培養(yǎng)植物愈傷組織（MS培養(yǎng)基），和采用液體懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)植物懸浮細胞，掌握鑒定細胞死活的方法。34選開驗證八、適用專業(yè)生物技術九、實驗地點生物與食品工程學院實驗室實驗一甲殼質、殼聚糖的制備【實驗目的】了解制備甲殼質、殼聚糖的工藝流程；掌握甲殼質的提取、制備原理及殼聚糖的檢測方法?！緦嶒炘怼考讱べ|存在于甲殼類動物(如蝦、蟹)的外殼，昆蟲表皮，軟體動物(如貝類、烏賊)的器官、菌類(如菇類、霉菌)的細胞壁。自然界每

5、年合成量高達100億噸，僅次于植物纖維素。甲殼質是1823年法國科學家Odier首次從蟹殼中提取出來的，由于甲殼質的性質非常穩(wěn)定，溶解性很差，限制了它的應用。經一個多世紀世界各地科學家對它在結構上進行改良、修飾，并開發(fā)應用研究，它的衍生物殼聚糖在工業(yè)、農業(yè)、畜產、漁業(yè)、食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)上得到廣泛應用，尤其是近十多年來，殼聚糖的動物試驗及臨床觀察得到科學家們的肯定，譽為人類第六生活要素(蛋白質、脂肪、維生素、礦物質和殼聚糖)。是一種功能性食品。從蝦殼提取甲殼質，工藝主要是將蝦殼的成份分離，蝦殼中含有無機鹽(主要為碳酸鈣)蛋白質和甲殼質。利用碳酸鈣能溶于鹽酸的機理，將其離析。蛋白質在堿性條件

6、下能被水解生成短肽及氨基酸，它們能溶于水，與甲殼質分離。本實驗首先采用鹽酸浸泡蝦殼除去鈣質，接著利用氫氧化鈉煮沸除去蛋白，之后水洗；用高錳酸鉀與硝酸氧化脫色干燥得白色制品為甲殼質。甲殼質在堿性條件下脫去乙酰基，生成聚胺糖。工業(yè)上很難100脫去乙?；怨I(yè)制得的實際上是甲殼質和聚葡胺糖兩個結構單元的結合，稱為殼聚糖。殼聚糖結構中有胺基(NH2)，具堿性，因此，它能溶于很多酸，如硫酸、鹽酸、胃酸等，可以用游離氨基含量的來檢測乙?；拿撊コ潭?。【儀器、材料與試劑】1實驗材料與試劑蝦殼；34%的氫氧化鈉；50的氫氧化鈉；56%的鹽酸；5%的高錳酸鉀；1%的硝酸；1mol/L的鹽酸；0.1mol/L

7、的氫氧化鈉；溴酚蘭指示劑。2儀器設備燒杯1000mL；三角瓶500mL；三角瓶100mL；大試管夾；水浴鍋；烘箱；堿式滴定管；鐵架臺；磁力攪拌器；電爐等?！緦嶒灢襟E】1蝦殼處理：將蝦殼洗凈，粉碎，稱重。2甲殼質制備：用56%的鹽酸于室溫（20）浸泡蝦殼24小時，不斷攪拌。鹽酸體積（ml）與蝦克重量（g）比為10（V/W=10）；取沉淀水洗3次后加入34%的氫氧化鈉（V/W=10）煮沸12小時，取沉淀水洗；加0.5%的高錳酸鉀攪拌反應約1小時，沉淀水洗;再加入1%的硝酸于6070反應3040分鐘，產物水洗、干燥、稱重。3殼聚糖的制備：于燒瓶中加入上述甲殼質10克再加入90-100ml的濃度為10

8、的NaOH，沸水浴反應30-40分鐘后，停止反應干燥稱重。4游離氨基含量的測定：方法1：精確稱取殼聚糖0.30克，置于20ml的錐瓶中，移取30ml0.1mol/L的鹽酸溶液，室溫下溶解（若粘度太大可加少許蒸餾水）。加入2滴溴酚蘭指示劑，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至紫色，平行滴定三份，按下式計算游離氨基含量：方法2：采用分光光度法檢測殼聚糖的含量，檢測殼聚糖的含量/純度（選做）。【結果與分析】計算甲殼質的提取率和游離氨基含量并分析與理論值之間的差異?！舅伎碱}】甲殼質的提取過程中用了哪些試劑，各起到了什么作用？實驗二液體發(fā)酵法生產鏈霉素（選做）【實驗目的】學習液體發(fā)酵的方法；學習鏈霉素

9、的發(fā)酵方法及抗生素的檢測和鑒定方法?！緦嶒炘怼客呖怂孤⊿elmanA.Waksman）于1943年分離到一株灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus），能產生對革藍氏陽性細菌和藍氏陰性細菌都有抗菌作用的一種新的抗生素鏈霉素。鏈霉素和其它抗生素一樣氏微生物的次級代謝產物。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素?；疑溍咕谙率鰲l件下產生鏈霉素。對細胞足夠的供氧；存在低濃度無機磷酸鹽；足夠的葡萄糖和足夠高濃度的含氮物質。在發(fā)酵培養(yǎng)基上，鏈霉素的發(fā)酵分3個階段：生長階段，菌絲形成，需氧量極大，在兩天內形成鏈霉素不多；成熟階段，菌絲及重量保持穩(wěn)定，葡萄糖及其他碳源在培養(yǎng)基中消失，形成鏈霉素；老化階段

10、，有許多鏈霉素形成，然后鏈霉素產生停止，濃度下降，pH上升，菌絲自溶，需氧量減少，此時停止發(fā)酵。在中性溶液中，鏈霉素成為3價陽離子故可用陽離子交換樹脂吸附，然后進行洗脫和收集。二次洗脫液要通過高交聯(lián)度的氫型樹脂，以除去陽離子、無機雜質和小分子的有機雜質。精制液用硫酸或氫氧化鋇調至pH4.55.0，再加入適量的活性碳，常溫下脫色，可得到鏈霉素精制液。紙層析是鑒別抗生素的方法之一，常用8個溶劑系統(tǒng)進行紙層析，層析后進行生物顯色并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對未知抗生素進行鑒定。本實驗采用其中一個溶劑系統(tǒng)，并用標準鏈霉素溶液作為對照對發(fā)酵液進行鑒定。【儀器、材料與試劑】儀器5L發(fā)酵罐恒溫搖床冷凍離心機

11、高壓滅菌鍋等材料灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusAS4.1095（鏈霉素產生菌，中國菌種保藏中心）大腸桿菌E.coliK12S（用于生物顯色）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,用于生物顯色）豌豆正丁醇三角瓶（50Ml）新華3號濾紙層析缸（30cm10cm）搪瓷盤（25cm15cm5cm）毛細管培養(yǎng)皿試劑牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.47.6，121高壓蒸汽滅菌30min豌豆培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，豌豆提取液1L（以NH2計，100mL含1214mg），pH7.07.2。高壓蒸

12、汽滅菌（105，30min）查氏培養(yǎng)基鏈霉素標準溶液（10mg/mL）：將鏈霉素溶于去離子水中，無菌濾膜過濾后備用展層溶劑系統(tǒng)：水飽和的正丁醇【實驗步驟】斜面孢子的制備用接種環(huán)挑取冰箱中保藏的菌種接種于豌豆培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，于27恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)67d，即可得到斜面孢子。母瓶培養(yǎng)液的制備用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基表面上的孢子接種于滅菌的含有50mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27搖瓶200r/min培養(yǎng)72h即成母瓶培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)液的制備無菌操作取2mL母瓶培養(yǎng)液接種于含有100mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27恒溫搖床200r/min培養(yǎng)34d。發(fā)酵培養(yǎng)三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取4mL種子培養(yǎng)液接種于含有

13、200mL豌豆培養(yǎng)基的500mL大三角瓶中，于28恒溫搖床200r/min培養(yǎng)1215d進行鏈霉素發(fā)酵。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中裝入3L豌豆培養(yǎng)基，滅菌后接入60mL種子培養(yǎng)液，在控制條件下進行鏈霉素發(fā)酵。發(fā)酵液預處理發(fā)酵結束后，將發(fā)酵液在低溫條件下12000r/min離心，上清即為含有鏈霉素的樣品，如果不進行鏈霉素的分離純化，可直接對發(fā)酵液進行抗生素抑菌實驗和紙層析生物顯色分析鑒定。發(fā)酵液抑菌實驗在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，待其表面干燥后將小鋼管垂直置于平板表面，取發(fā)酵液0.1mL注入小鋼管中，于37恒溫培養(yǎng)24h后觀察結果。鏈霉素的紙層析鑒定點樣：

14、在距新華濾紙（25cm19cm）底端2.5cm處劃一道橫線，用毛細管將發(fā)酵清液和標準鏈霉素溶液（10mg/mL）點在濾紙的橫線上。每個樣品之間距離2cm。層析：將點好樣的濾紙做成圓筒狀，置于含有展層溶劑系統(tǒng)的層析缸中，于2025上行擴展2025cm后取出，揮發(fā)除凈溶劑。顯影（生物顯影法）：將濾紙貼在接種有大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的瓊脂平板上，置冰箱中(10，4h)，使濾紙上的抗生素滲透到平板上，然后于3035培養(yǎng)1620h，根據(jù)平板上樣品抑菌區(qū)的位置判斷抗生素的類型。【結果與分析】觀察鏈霉素發(fā)酵液對細菌的抑制作用及鏈霉素紙層析生物顯色圖譜。發(fā)酵液離心上清抑菌結果，可觀察到明顯的抑菌圈，說明發(fā)酵

15、液中含有抗菌物質。發(fā)酵液和標準鏈霉素紙層析后經生物顯色結果，可觀察到抑菌圈的位置在相同的位置，初步說明發(fā)酵液中的抗菌物質為鏈霉素。【實驗安排】第一天：配制試劑、滅菌，接種斜面孢子（斜面孢子的制備、母瓶培養(yǎng)液的制備、種子培養(yǎng)液的制備、發(fā)酵培養(yǎng)液的接種：在教師指導下由學生利用課余時間完成。全過程大約需要2628d）。第二天：發(fā)酵液預處理、發(fā)酵液抑菌實驗（24h后觀察記錄結果）和鏈霉素的紙層析及觀察記錄結果。實驗三抗生素的分離和鑒別（薄層層析法）【實驗目的】掌握薄層層析法分離抗生素的原理與方法；了解生物顯影法在抗生素鑒定中的應用?！緦嶒炘怼勘訉游鍪且环N微量而快速的層析方法。把吸附劑或支持劑均勻的

16、涂布于玻璃板（或滌綸片基）上成一薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用合適的展層劑進行展開而達到分離、鑒定和定量的目的。為了使要分析的樣品中的各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺由于它們的吸附性能良好，是應用最廣泛的吸附劑，硅藻土和纖維素則是分配層析中最常用的支持劑。在吸附劑或支持劑中添加合適的粘合劑后再涂布，可使薄層粘牢在玻璃板上。在吸附層析中，雖用相同的吸附劑和溶劑系統(tǒng)，但不同性質的抗生素由于其吸附能力的差異，比移植（Rf）也不同。因此，即使是性質極為接近的同組抗生素的各個組分，在合適的溶劑系統(tǒng)中展開，也能達到分離的目的。通過薄層色譜分離后的化合物經生物顯跡確定斑點的

17、位置后，可求得其Rf值，將該Rf與同一薄層上標準品的Rf作比較就可初步鑒別樣品中的抗生素。【實驗用品】器材硅膠GF254玻璃板（100mm200mm）層析缸（20個）測度盤（19.5cm34cm的玻璃板筐）微量注射器、濾紙、玻璃等烘箱（2臺）、培養(yǎng)箱（2臺）、滅菌鍋（1臺）、超凈工作臺（1臺）試劑配制展層溶劑系統(tǒng)：正丁醇：乙酸：水（3：1：1）生物顯影用培養(yǎng)基：蛋白胨6g，酵母膏3g，牛肉膏1.5g，瓊脂20g，水1000mL，pH6.5（滅菌后）。生物顯影時，測度盤內培養(yǎng)基分上下兩層，上層培養(yǎng)基須另加0.5%的葡萄糖。生物顯影用枯草桿菌芽孢懸浮液將枯草桿菌（Bacillussubtilis1

18、ATTC6633）接種在肉湯瓊脂大斜面培養(yǎng)基上（2支），37培養(yǎng)7d。用0.85生理鹽水將枯草桿菌芽孢洗下，再用滅菌玻璃珠將芽孢分散，用0.85生理鹽水稀釋成12108/mL芽孢懸液。將此懸液于65水液中保溫30min，冷卻后保存于冰箱內，可使用一個月。使用前，最好先作抑菌試驗，以確定每100mL上層培養(yǎng)基需加入芽孢懸液的量。材料枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisTATTC6633)；鏈霉素、卡那霉素等抗生素純品及粗制抗生素樣品若干種（鏈霉素或卡那霉素粗制品）?！緦嶒灢襟E】薄層的制備制薄層用的玻板預先用洗液洗凈并烘干，玻板表面要求光滑。將硅膠GF254和雙蒸水（硅膠：雙蒸水10：2

19、5）于燒杯中攪拌均勻后用玻棒迅速涂布鋪平，輕輕振動玻板，使其分布均勻，鋪成厚度0.25mm的薄層板，在空氣中涼干（或在60烘箱中烘干）后移至110烘箱中活化1h，取出置干燥器中備用。點樣距薄板一端2cm處每隔2cm作一記號(用鉛筆輕輕點一下，切不可將薄層刺破)，用50uL微量注射器取抗生素純品或粗制品（分別溶于少量的甲醇中，濃度為0.5mg/mL）溶液在記號處點樣，點樣量為20uL。注意控制樣點擴散直徑不超過3mm。展開將薄板點樣一端放入盛有展開劑的層析缸中（注意樣點不可直接與展開劑相接觸），展層至溶劑前沿距頂端12cm處時取出薄板，在溶劑前沿處作記號?？諝庵袥龈?，除盡溶劑。生物顯影往測定盤內

20、倒入生物測定培養(yǎng)基150mL，放平。待凝固后再倒入60mL帶枯草桿菌的上層培養(yǎng)基，完全凝固后，將層析過的層析板（點樣的一面）直接貼在瓊脂表面，放置15min，取下層析板，將盤置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約16h后取出觀察實驗結果。結果處理用筆描下抑制圈所在的位置和形狀，計算各抗生素樣品的Rf值?！舅伎碱}】薄層色譜的Rf值是鑒別化合物的主要參數(shù)，請指出再薄層色譜過程中影響化合物Rf值的主要因素有哪些？假設某試樣的Rf值與標準品相同，請問能否據(jù)此確定該試樣與標準抗生素同質？實驗四植物細胞/組織培養(yǎng)（略）與細胞活性的鑒定一、目的練習以堿性染料中性紅和熒光染料（FDA，F(xiàn)M4-64）進行活體染色的方法。

21、通過活體染色及質壁分離，進行細胞死活的鑒定。二、原理用某種對植物無害的染料稀溶液對活細胞進行染色稱活體染色。中性紅是常用的活體染料之一。在中性或微堿性環(huán)境下，植物的活細胞能大量吸收中性紅并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，進入液泡的中性紅解離出大量陽離子而呈櫻桃紅色,原生質及壁不染色。死細胞的液泡已消失因而不產生液泡著色現(xiàn)象，中性紅陽離子卻與帶一定負電荷的原生質及細胞核結合而使原生質及細胞核染色。細胞的熒光染色是目前細胞生物學常用的方法，F(xiàn)DA與FM4-64在酯酶的作用下水解釋放出熒光素，從而發(fā)出熒光?；罴毎毎ッ富钚暂^高，能水解FDA釋放熒光素，從而顯示出熒光；而死細胞的酯酶喪失活性，不能水解

22、FDA，不能顯示出熒光。FM4-64在熒光顯微鏡下紅色，經酯酶水解后，顯示無色。因而，活細胞紅色消失或較暗，死細胞紅色較強，以區(qū)分細胞的死活。成長的細胞是一個滲透系統(tǒng)，活的原生質具有選擇透性，原生質內部包含著一個大液泡，具有一定的溶質勢。當細胞與外界低水勢溶液接觸時，細胞內的水分外滲，原生質隨著液泡一起收縮而發(fā)生質壁分離；其后，當與清水（或高水勢溶液）接觸，細胞又因液泡的吸水膨脹而發(fā)生質壁分離復原。死細胞因其原生質的選擇透性已遭破壞，故與低水勢溶液接觸時不產生質壁分離。三、材料、儀器設備及試劑1.材料：洋蔥鱗莖；大麥種子。2.儀器設備：刀片；鑷子；吸水紙；酒精燈；載玻片；蓋玻片；膠頭滴管；顯微鏡；熒光顯微鏡或熒光燈。3.試劑：0.8mol/