轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用檢測(cè)方法及數(shù)字PCR技術(shù)介紹進(jìn)展

1、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用檢測(cè)方法及數(shù)字PCR技術(shù)介紹進(jìn)展一、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用檢測(cè)方法二、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品數(shù)字PCR技術(shù)三、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品快速檢測(cè)技術(shù)主要內(nèi)容一、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通用檢測(cè)方法主要內(nèi)容轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR是所有檢測(cè)策略中檢測(cè)范圍最廣的檢測(cè)方法，可以快速的對(duì)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行初篩。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR篩選PCR檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域?yàn)橥庠床迦肫蔚耐ㄓ迷@種檢測(cè)策略可以對(duì)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行初篩。由于不同的轉(zhuǎn)基因品系通常含有不同的篩選元件，因此，篩選元件的種類決定了篩選PCR檢測(cè)結(jié)果的可信度。通過收集全球已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物，對(duì)所有轉(zhuǎn)基因品系中的篩選元件進(jìn)行分析。挑選出了可以覆蓋全部轉(zhuǎn)基因品系

2、的篩選元件組合。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR在所有的391個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中，單一品系占了253項(xiàng)，其中，主要進(jìn)出口貨物玉米、大豆、油菜、棉花、土豆以及甜菜等物種占比較大（150/253）雖然轉(zhuǎn)基因作物總數(shù)較多，但是其中絕大部分品系都沒有實(shí)現(xiàn)商業(yè)化（黃色vs藍(lán)色）。MAIZECOTTONPOTATOCANOLASOYBEAN本課題組通過與轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)單位進(jìn)行交流溝通，得到了所有已經(jīng)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)化圖譜以及外源插入序列，并在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因品系篩選元件覆蓋度的分析。1775451通過與全球各大轉(zhuǎn)基因研發(fā)公司達(dá)成數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)讓協(xié)議，共獲得包括玉米、大豆、油菜、甜菜、苜蓿在內(nèi)的35種轉(zhuǎn)化事件

3、。通過收集資料，獲得其余17種轉(zhuǎn)化事件的插入信息。通過高通量測(cè)序，獲得14中轉(zhuǎn)化事件的插入信息。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR插入信息收集挑選基因多序列比對(duì)特異性分析轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR靈敏度分析高通量檢測(cè)方法/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCRCaMV 35s啟動(dòng)子NOS終止子CaMV 35s終止子pat基因PINII基因E9基因Rbc基因CaMV 35S啟動(dòng)子多序列比對(duì)結(jié)果轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR對(duì)于篩選元件中的可變序列，本課題組進(jìn)行了不同品系之間的比對(duì)。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR除了以上篩選元件覆蓋的轉(zhuǎn)基因品系之外，還有三種轉(zhuǎn)基因品系是沒有任何篩選元件的（DAS40278,

4、 DP305423, CV127），因此我們?cè)诤Y選元件的組合中，加入了三種轉(zhuǎn)化事件引物探針。轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR7個(gè)篩選元件3個(gè)轉(zhuǎn)化事件內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因商業(yè)化轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR商業(yè)化轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化事件全覆蓋靈敏度達(dá)到0.1%，與歐盟轉(zhuǎn)基因檢測(cè)限一致比行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)更高的元件覆蓋度（如Topas19/2）現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)能滿足商業(yè)化事件的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)策略篩選PCR持續(xù)增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因品系篩選PCR配套陽(yáng)性物質(zhì)三、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展歷程第一代PCR基于凝膠電泳的PCR第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR第三代PCR基于分割體系的絕對(duì)定量PC

5、R精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR發(fā)展歷程第一代PCR基于凝膠電泳的PCR最基礎(chǔ)的分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，是所有PCR檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)。發(fā)展歷程第一代PCR基于凝膠電泳的PCR發(fā)展歷程第一代PCR基于凝膠電泳的PCR優(yōu)勢(shì)缺陷操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉對(duì)擴(kuò)增儀器要求低靈敏度較低結(jié)果判讀依賴人為因素?cái)U(kuò)增后開蓋檢測(cè)，易產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)室污染發(fā)展歷程第一代PCR基于凝膠電泳的PCR隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)檢測(cè)靈敏度要求的提高，定性PCR已經(jīng)逐漸退出了轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的歷史舞臺(tái)。雖然現(xiàn)階段的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)還是以定性檢測(cè)為主，但是定量PCR已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中。發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR定性PCR的深化，靈敏度和

6、結(jié)果判讀方面有了較大的提高。發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR優(yōu)勢(shì)缺陷操作簡(jiǎn)單，結(jié)果判定容易擴(kuò)增穩(wěn)定性強(qiáng)受到擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)的影響定量檢測(cè)較為困難判讀不受人為因素影響發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR雖然定量PCR具有較好的定量能力，但是現(xiàn)階段絕大多數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)都是用這種方法進(jìn)行定性檢測(cè)的。發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR梯度稀釋誤差擴(kuò)增曲線誤差標(biāo)準(zhǔn)曲線誤差發(fā)展歷程第二代PCR基于擴(kuò)增曲線的定量PCR多種因素產(chǎn)生的誤差導(dǎo)致定量PCR在轉(zhuǎn)基因成分的定量鑒定方面具有明顯的局限性，比如定量穩(wěn)定性較差，定量靈敏度較低等。因此，開發(fā)以及

7、應(yīng)用更加簡(jiǎn)便的定量檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的趨勢(shì)和必經(jīng)之路。發(fā)展歷程第三代PCR基于分割體系的絕對(duì)定量PCR1999年，Bert等人通過將原始定量PCR的體系進(jìn)行分割，提出了一種新型的依賴于計(jì)數(shù)的核酸定量檢測(cè)策略。這種策略理論上可以不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行核酸的絕對(duì)定量。該種檢測(cè)策略成為了數(shù)字PCR的雛形。數(shù)字PCR簡(jiǎn)介DNA2W-2000W個(gè)反應(yīng)體系數(shù)字PCR數(shù)字PCR是一種新型的核酸信號(hào)的定量檢測(cè)手段。與傳統(tǒng)的定量PCR相比，數(shù)字PCR具有不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線絕對(duì)定量以及單拷貝檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR簡(jiǎn)介Digital PCR是一種基于單分子模版PCR擴(kuò)增，無需使用標(biāo)準(zhǔn)曲線

8、，對(duì)樣品核酸進(jìn)行定量的分析方法。通過對(duì)陽(yáng)性PCR反應(yīng)和陰性PCR反應(yīng)的計(jì)數(shù)，來計(jì)算目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)目。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR簡(jiǎn)介通過陰性體系和陽(yáng)性體系的數(shù)量，根據(jù)泊松分布，即可計(jì)算得出反應(yīng)中目的片段的絕對(duì)拷貝數(shù)。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR分類市面上常見的數(shù)字PCR平臺(tái)按照微滴分割方式來說，主要分為微滴式平臺(tái)和芯片式平臺(tái)。Vs精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR分類芯片式數(shù)字PCR芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)是依靠微流控芯片進(jìn)行原始體系分割的。這種分割方法通常具有較高的分割穩(wěn)定性，體系之間的影響較小，因此反應(yīng)之間穩(wěn)定性較高常見芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)包括Fluidigm BioMark平臺(tái)以及Q

9、uantStudio 3D平臺(tái) 數(shù)字PCR分類 Fluidigm BioMark平臺(tái) 最原始的數(shù)字PCR平臺(tái)，開創(chuàng)了芯片式數(shù)字PCR的先河；唯一一種可以對(duì)單孔中熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的平臺(tái)，可以產(chǎn)生單孔擴(kuò)增曲線；其分支平臺(tái)可以進(jìn)行多基因的高通量檢測(cè)；靈活性較差，只能進(jìn)行規(guī)定數(shù)量的樣品檢測(cè)，耗材價(jià)格較為昂貴；分割產(chǎn)生體系數(shù)較少，較其余平臺(tái)的檢測(cè)來說，檢測(cè)產(chǎn)生的不確定性較高；優(yōu)勢(shì)缺陷數(shù)字PCR分類 QuantStudio 3D平臺(tái) 基于終點(diǎn)熒光檢測(cè)法的芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)；物理芯片式的分割，可以極大的避免熒光信號(hào)之間的交叉干擾；生成微滴數(shù)較多，檢測(cè)產(chǎn)生的不確定性較低；受制于檢測(cè)平臺(tái)，單次只能進(jìn)行8個(gè)

10、芯片的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)通量較低；操作較為復(fù)雜，單位樣品操作時(shí)間較長(zhǎng)；優(yōu)勢(shì)缺陷數(shù)字PCR分類微滴式數(shù)字PCR微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)依靠油包水結(jié)構(gòu)進(jìn)行原始體系分割。這種分割方法具有較高的反應(yīng)靈活性以及反應(yīng)效率，但是由于油包水結(jié)構(gòu)的熱脹冷縮，因此反應(yīng)的穩(wěn)定性一般不如芯片式數(shù)字PCR。常見微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)包括Bio-Rad QX100/200平臺(tái)以及RainDance RainDrop平臺(tái)（已被Bio-Rad收購(gòu)） 數(shù)字PCR分類 Bio-Rad QX100/200平臺(tái) 該平臺(tái)的出現(xiàn)開創(chuàng)了微滴式數(shù)字PCR的先河；通過油包水進(jìn)行反應(yīng)體系分割，速度快，成本低，可以同時(shí)進(jìn)行96個(gè)樣品檢測(cè)；操作簡(jiǎn)便，液體轉(zhuǎn)移

11、步驟比較少，不易受到環(huán)境因素的干擾；油包水結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是決定反應(yīng)成敗的根本，受這方面影響較大；擴(kuò)增步驟通過PCR儀進(jìn)行，較于其他平臺(tái)，受基質(zhì)效應(yīng)影響明顯；優(yōu)勢(shì)缺陷數(shù)字PCR分類 RainDance RainDrop平臺(tái) 最新型的微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)，油滴分割技術(shù)較為成熟；單個(gè)反應(yīng)體系可以生成2000萬個(gè)小微滴，在所有平臺(tái)中數(shù)量最高；儀器自動(dòng)化水平高，液體轉(zhuǎn)移步驟比較少，不易受到環(huán)境因素的干擾；微滴生成過程需要單獨(dú)的加壓裝置，實(shí)驗(yàn)室占用面積較大；試劑耗材多為為封閉系統(tǒng)，耗材成本較高；優(yōu)勢(shì)缺陷數(shù)字PCR分類由于不同的數(shù)字PCR平臺(tái)之間具有不同的體系分割數(shù)量，因此，對(duì)于跨平臺(tái)之間數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性分析成為

12、了數(shù)字PCR數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵平臺(tái)之間穩(wěn)定性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同數(shù)字PCR平臺(tái)之間取得檢測(cè)結(jié)果的平均值相對(duì)來說都比較穩(wěn)定。但是由于體系分割數(shù)量的不同，每組之間的RSD值會(huì)有較為明顯的差異。體系分割數(shù)量越大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性越高。數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)1. 對(duì)于常規(guī)的real-time PCR, 樣品與樣品之間的比較基于一致的PCR擴(kuò)增效率。Digital PCR則無需。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)1. 對(duì)于常規(guī)的real-time PCR, 樣品與樣品之間的比較基于一致的PCR擴(kuò)增效率。Digital PCR則無需。2. Digital PCR, 并不依賴閾值來決定靶目標(biāo)的數(shù)量。Ct數(shù)字PC

13、R的優(yōu)勢(shì)1. 對(duì)于常規(guī)的real-time PCR, 樣品與樣品之間的比較基于一致的PCR擴(kuò)增效率。Digital PCR則無需。2. Digital PCR, 并不依賴閾值來決定靶目標(biāo)的數(shù)量。3. 可以檢測(cè)單個(gè)靶目標(biāo)分子，甚至是低濃度的混雜樣品。 數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)1. 對(duì)于常規(guī)的real-time PCR, 樣品與樣品之間的比較基于一致的PCR擴(kuò)增效率。Digital PCR則無需。2. Digital PCR, 并不依賴閾值來決定靶目標(biāo)的數(shù)量。3. 可以檢測(cè)單個(gè)靶目標(biāo)分子，甚至是低濃度的混雜樣品。 4. 4.無需標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量(copies per reaction)。數(shù)字PCR的優(yōu)

14、勢(shì)1. 對(duì)于常規(guī)的real-time PCR, 樣品與樣品之間的比較基于一致的PCR擴(kuò)增效率。Digital PCR則無需。2. Digital PCR, 并不依賴閾值來決定靶目標(biāo)的數(shù)量。3. 可以檢測(cè)單個(gè)靶目標(biāo)分子，甚至是低濃度的混雜樣品。 4. 無需標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行絕對(duì)定量(copies per reaction)。5. 相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)理論上更加準(zhǔn)確。特別是在樣品之間差異倍數(shù)不大的狀態(tài)下，使用數(shù)字PCR 更為準(zhǔn)確。Sample 1Sample 220% difference數(shù)字PCR的局限1、數(shù)字PCR通常具有較高的實(shí)驗(yàn)成本2、數(shù)字PCR對(duì)于操作者的專業(yè)性要求更高；較于常規(guī)PCR檢測(cè)方法來說3、

15、數(shù)字PCR數(shù)據(jù)的處理以及分析有更高的要求；數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR作為一種新型的分子生物學(xué)擴(kuò)增技術(shù)，較于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高，穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)、可以絕對(duì)定量等優(yōu)勢(shì)，因此，現(xiàn)階段，數(shù)字PCR在核酸信號(hào)的精準(zhǔn)定性定量檢測(cè)中已經(jīng)取得了較為廣泛的應(yīng)用。本PPT將從不同方面著手，重點(diǎn)介紹一下數(shù)字PCR在不同領(lǐng)域中的研究進(jìn)展。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè) 精確度高數(shù)字PCR特點(diǎn)研究?jī)?nèi)容 靈敏度好 穩(wěn)定性好 針對(duì)我國(guó)數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)檢 測(cè)技術(shù)空缺 以常用的35s，nos兩種篩選元件為研究對(duì)象 建立一套針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物篩查方法。實(shí)現(xiàn)了數(shù)字PCR在國(guó)內(nèi)的首次

16、標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)不同數(shù)字平臺(tái)具有良好穩(wěn)定性不同平臺(tái)間具有相同的檢測(cè)效果數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增穩(wěn)定篩選基因?yàn)殛?yáng)性的品系擴(kuò)增穩(wěn)定篩選基因?yàn)殛幮缘钠废禑o擴(kuò)增數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室間具有良好的穩(wěn)定性本方法后續(xù)可以推廣轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測(cè)體系數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系 精確度高數(shù)字PCR特點(diǎn)研究?jī)?nèi)容 靈敏度好 穩(wěn)定性好 針對(duì)我國(guó)數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的空缺 以常見的7種轉(zhuǎn)基因玉米品系為研究對(duì)象 建立一套針對(duì)轉(zhuǎn)基因作物品系定量檢測(cè)方法。為后續(xù)數(shù)字PCR技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

17、奠定了理論基礎(chǔ)絕對(duì)定量不依賴標(biāo)曲數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系節(jié)約成本，定量數(shù)字協(xié)同分析選取擴(kuò)增曲線均勻的組合用于后續(xù)定量實(shí)驗(yàn)內(nèi)參外源組的擴(kuò)增曲線均一易分析數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系品系內(nèi)擴(kuò)增穩(wěn)定品系之間無交叉擴(kuò)增所有引物探針特異性好數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系在測(cè)定濃度（100-0.5%）中，所有品系具有良好的線性穩(wěn)定性數(shù)字PCR研究進(jìn)展數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因品系絕對(duì)定量檢測(cè)體系對(duì)所有品系的0.5%質(zhì)量百分比的樣品穩(wěn)定定量；0.1%組有陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)生；絕對(duì)靈敏度可以達(dá)到

18、單拷貝。數(shù)字PCR標(biāo)準(zhǔn)化雖然數(shù)字PCR較于傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)有眾多的優(yōu)勢(shì)，但是如果沒有標(biāo)準(zhǔn)方法支持的話，數(shù)字PCR的推廣就會(huì)相當(dāng)困難。因此，我們課題組于2014年開始籌備數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)的開發(fā)，并于今年年初實(shí)現(xiàn)了國(guó)內(nèi)首個(gè)數(shù)字PCR標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布。精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)數(shù)字PCR數(shù)字PCR標(biāo)準(zhǔn)化本標(biāo)準(zhǔn)中，以數(shù)字PCR作為檢測(cè)手段，以不同的篩查元件作為檢測(cè)目的片段，實(shí)現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)行絕大多數(shù)商業(yè)化品系的覆蓋檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)作為國(guó)內(nèi)首個(gè)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)數(shù)字PCR的推廣具有重要的價(jià)值和意義。三、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)1990年，Nucleic Acids Research上率先發(fā)表了Mercier等關(guān)于血液的直接PCR技術(shù)的論文。商業(yè)化企業(yè)也取得了進(jìn)展，Thermo和Takara公司先后推出了能夠直接利用植物葉片組織一步提取基因組DNA，并結(jié)合高耐受性聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增的試劑盒。與此同時(shí)，Envirologix公司也推出了基于NEMA的針對(duì)部分病原微生物的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。61現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)直接擴(kuò)增技術(shù)存在的問題植物組織由于存在細(xì)胞壁，干擾物質(zhì)復(fù)雜，種子中存在高脂、高淀粉或者高蛋白的各種不同復(fù)雜情況，直接提取試劑和方法的開發(fā)一直很滯后。以上的試劑盒均未充分考慮檢測(cè)對(duì)象的復(fù)雜性，僅能對(duì)最常見的葉片組織和少量檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)未考慮真菌等情況，也未充分