熒光PCR定量質(zhì)量控制及其防污染措施方案

1、.wd.wd.wd.解放軍第三0二醫(yī)院 王海濱寫(xiě)在課前的話近幾年在臨床檢測(cè)病毒核酸和細(xì)菌核酸上，熒光定量PCR技術(shù)越來(lái)越廣泛。但是如何進(jìn)展治療控制以及出現(xiàn)污染后怎樣進(jìn)展去除污染本文主要講述怎樣來(lái)防止污染的產(chǎn)生。一、熒光PCR定量的概述一熒光PCR定量的原理實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，是指在 PCR 反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)展定量分析的方法。 常規(guī)的PCR也就是電泳PCR，它是合成一個(gè)正向引物和反向引物為目的模板，即DNA或RNA作為一個(gè)模板擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過(guò)跑電泳的方式來(lái)檢測(cè)它存在與否，是相對(duì)量的變化。由于跑電泳經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)物

2、外泄，因此污染的幾率比較高。近幾年 PCR 擴(kuò)增時(shí)在參入一對(duì)引物的同時(shí)參入單個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記單個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和單個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR 擴(kuò)增時(shí)， Taq 酶的5端3端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)別離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有單個(gè)熒光分子構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物構(gòu)成完全同步。通過(guò)熒光物質(zhì)參入和TapMan探針技術(shù)來(lái)做實(shí)時(shí)熒光PCR,防止了電泳檢測(cè)結(jié)果的過(guò)程,使整個(gè)PCR過(guò)程從擴(kuò)增到檢測(cè)都在一個(gè)封閉的狀態(tài)。熒光集團(tuán)目前臨床常用的有

3、兩個(gè)，一個(gè)是SYBR green，一個(gè)是TapMan探針。SYBR green是一類熒光染料，能 與所有的 DNA 雙鏈相結(jié)合，對(duì) DNA 模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如 TaqMan 探針。 變性后雙螺旋變成單鏈，然后作為擴(kuò)增的模板。在擴(kuò)增的過(guò)程中由變性到負(fù)性擴(kuò)出了另一條鏈和模板DNA進(jìn)展退火變成雙鏈。這時(shí)SYBR green染料與 DNA 雙鏈結(jié)合,發(fā)出熒光信號(hào)。用SYBR green熒光染料來(lái)作為指示劑時(shí)，中間要加一個(gè)溶解曲線來(lái)證實(shí)它的特異性的問(wèn)題。另一個(gè)是TapMan探針，在兩個(gè)引物中間設(shè)置一條特異性的探針，它標(biāo)記有熒光染料通過(guò)激發(fā)和檢測(cè)的過(guò)程來(lái)檢測(cè)特異性擴(kuò)增模板的存在。二PCR原理圖

4、三定量原理定量原理：初始模板量的對(duì)數(shù)與 C(T) 循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系。初始 DNA 量越多 , 熒光到達(dá)某一值域值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少。域值Ct 值，熒光曲線由潛伏期進(jìn)入對(duì)數(shù)期的拐點(diǎn)。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系如圖二，根據(jù)樣品擴(kuò)增到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量圖一為 PCR 擴(kuò)增曲線圖二為：標(biāo)準(zhǔn)曲線四 TaqMan探針?lè)═aqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩?PCR 技術(shù)，其核心是利用 Taq 酶的3p5p 外切核酸酶活性，切斷探針產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合,所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在 TaqMan 探針?lè)ǖ亩?PCR 反響體系中，包括一對(duì) PCR

5、引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間 . 探針的 5p 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán) (Reporter，R) ，如 FAM 、VIC 等，3p 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher，Q) ，如 TAMRA 等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著 PCR 的進(jìn)展， Taq 酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其 3p5p 外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán) , 其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以 , 每經(jīng)過(guò)一個(gè) PCR 循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)度代表了模板 DNA

6、 的拷貝數(shù)。二、質(zhì)量指標(biāo)熒光PCR質(zhì)量控制。一個(gè)好的結(jié)果必須有一個(gè)好的試劑，有合格的操作人員，有合格的環(huán)境等因素。一特異性首先一個(gè)好的試劑要有特異性?，F(xiàn)在臨床檢驗(yàn)用的試劑，都是要求國(guó)家藥監(jiān)局所批的試劑，因此它序列的特異性都是通過(guò)專家所認(rèn)證的。但是用SYBR green染料進(jìn)展定量時(shí)，要注意在放射學(xué)應(yīng)用之前或在確定放射學(xué)是不是可用時(shí)，要通過(guò)溶解曲線來(lái)對(duì)這個(gè)方法做一個(gè)特異性的評(píng)價(jià)。另外要注意穿插性的問(wèn)題，特別是做細(xì)菌16sRNA的檢測(cè)，試劑制備是在國(guó)家嚴(yán)格要求的GMP廠房里生產(chǎn)。試劑出廠后運(yùn)輸?shù)綑z測(cè)單位，他們使用的環(huán)境 基本上不具備GMP廠房的條件。因此如果檢測(cè)的試劑要求比較高，在GMP廠房或在一

7、個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)室里面才能做的比較合格，而在一個(gè)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室，雖然通過(guò)驗(yàn)收但是環(huán)境要比GMP廠房要求的環(huán)境差，所以兩個(gè)應(yīng)該有同步性。就是說(shuō)在GMP廠房好的條件下生產(chǎn)的試劑，放到現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室里面也應(yīng)該得到同樣一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果我們現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)條件出現(xiàn)了穿插性的污染問(wèn)題，即我們環(huán)境里面就存在一個(gè)16sRNA這樣的菌株，那我們現(xiàn)有的檢測(cè)結(jié)果就沒(méi)有可靠性。二敏感性一個(gè)好的試劑要有好的敏感性。有的專家想通過(guò)增加模塊擴(kuò)增的量來(lái)提高敏感性，我們認(rèn)為是不科學(xué)的，從低碳的境地來(lái)講也是不科學(xué)的。目前我們所做的實(shí)驗(yàn)，參加模板的量是微量的，有的是3ul，有的是5ul，最多的是10ul。常規(guī)的應(yīng)用PCR反響體系一般是3

8、050ul。一些進(jìn)口的試劑用了100ul，這樣成本實(shí)際價(jià)格也非常高。我們現(xiàn)在3050ul的反響體系下，一般模板的量在510ul就足夠。如果從510ul變成了1020ul，雖然可以提高1倍的敏感性。但是里面的干擾物質(zhì)會(huì)相應(yīng)的增加，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。1擴(kuò)增效率試劑本身的擴(kuò)增效率應(yīng)該是最正確的擴(kuò)增效率，對(duì)檢測(cè)模板所設(shè)定的引物和探針的位置不唯一，它有好多位置，好多序列都可以設(shè)計(jì)。但是在不同的區(qū)域設(shè)計(jì)的不同引物和探針，它擴(kuò)增的效率可能有很大的差異。對(duì)于一個(gè)勢(shì)力雄厚或有經(jīng)歷的實(shí)體公司常常是設(shè)計(jì)很多條引物和探針，并且準(zhǔn)確到個(gè)別堿基，然后通過(guò)理論、軟件，更重要要通過(guò)實(shí)踐的篩選，篩選出活性效率比較最高的一套引物

9、和探針來(lái)制作試劑。在整個(gè)PCR擴(kuò)增反響的效率和敏感性上，我們把它比喻成是跑步和跳高的關(guān)系。如圖三所示。這是典型的一個(gè)PCR擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光曲線，擴(kuò)了45個(gè)循環(huán)。我們可以看到從擴(kuò)增的初期在沒(méi)有熒光信號(hào)的情況下逐漸擴(kuò)增，擴(kuò)增到12個(gè)循環(huán)后檢測(cè)到了陽(yáng)性的擴(kuò)增信號(hào)，這個(gè)信號(hào)越來(lái)越放大，然后在10個(gè)信號(hào)左右到達(dá)平臺(tái)期。這條藍(lán)線是基線即為 CT 值，從第一個(gè)循環(huán)到第十二循環(huán)沒(méi)有跑步，十二個(gè)循環(huán)之后開(kāi)場(chǎng)跑，跑到最近也是最快的量是最大的。再上后整個(gè)模板里，含量最低的在最后，也到達(dá)了極限，這就是跑步。跳高就是到達(dá)平臺(tái)，量最大的標(biāo)本，這個(gè)反響孔到達(dá)一個(gè)高平臺(tái)，量最少的反響孔也應(yīng)該到達(dá)與量最大的同樣一個(gè)平臺(tái)度，這就是跳

10、高。不管原始模板量高中或低，一個(gè)好的試劑應(yīng)該以同樣的比例和速率往前移，移到最快，即跑的最快同時(shí)跳的最高。最后含量最低的這個(gè)反響孔也要跳到同樣的高度，這是一個(gè)好試劑的標(biāo)準(zhǔn)。曾經(jīng)對(duì)國(guó)內(nèi)的試劑進(jìn)展一個(gè)考核比較，發(fā)現(xiàn)同樣一個(gè)高中低的模板，按照理論擴(kuò)增時(shí)，有的試劑擴(kuò)增效率開(kāi)場(chǎng)跳的還很高，后來(lái)越跳越矮，這個(gè)實(shí)體生產(chǎn)廠家在探針設(shè)計(jì)合成或它的質(zhì)量、比例、數(shù)量等有問(wèn)題， Taq酶的活性也非常重要。圖三： Amplification Plots2添加劑添加劑，目前為了防止擴(kuò)增污染的，好多試劑公司，包括衛(wèi)生臨檢中心也要求，在實(shí)驗(yàn)的反響體系要參加一些 UNG 酶 ， UNG 酶 可以有效的防污染， 但是 UNG 酶

11、在防污染的同時(shí)在95 35分鐘要對(duì)它進(jìn)展滅活，否那么它會(huì)影響以后的擴(kuò)增。95 35分鐘能不能把 UNG 酶 滅活后來(lái)我們做了一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)955分鐘很難徹底的把 UNG 酶 滅活，因此它的存在對(duì)試劑的敏感性產(chǎn)生了影響，特別是對(duì)低拷貝反響孔的擴(kuò)增產(chǎn)生抑制的作用。另外關(guān)于內(nèi)標(biāo)的問(wèn)題，一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最重要的表達(dá)在重復(fù)性上，雖然敏感性越高越好，但是更重要的還是重復(fù)性，臨床醫(yī)生更注重同一個(gè)標(biāo)本在不同次檢測(cè)應(yīng)該獲得同樣一個(gè)值，雖然在基因檢測(cè)里不可能到達(dá)完全一樣，但至少要在一個(gè)范圍之內(nèi)。三重復(fù)性影響重復(fù)性的因素有很多。第一，儀器間的差異，能夠拿到臨床應(yīng)用的這些儀器間的差異不是特別大，但是在儀器使用過(guò)程中會(huì)

12、有好多影響因素。儀器使用不當(dāng)、電壓不穩(wěn)或維護(hù)不當(dāng)常常導(dǎo)致不同臺(tái)儀器的差異比較大。儀器的廠家要及時(shí)對(duì)儀器進(jìn)展維護(hù)、保養(yǎng)。第二，輔助儀器，離心機(jī)、移液器等，對(duì)于微量的實(shí)驗(yàn)比較重要。對(duì)于需要離心、沉淀或提純的實(shí)驗(yàn)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和定位時(shí)間要準(zhǔn)，離心機(jī)的校準(zhǔn)也非常重要。第三，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境，包括空間環(huán)境和構(gòu)造環(huán)境，為了防止污染盡可能要做一個(gè)物理的分割，也就是核酸的提取、擴(kuò)增和試劑配制要通過(guò)物理分割的方式分開(kāi)。第四， 實(shí)驗(yàn)室的溫度，用 Trizol 試劑 來(lái)沉淀或提取RNA，如果冬天外界溫度比較低， Trizol 就會(huì)結(jié)晶、沉淀，它裂 解病毒的效率就要明顯的低下，這時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。第五，操作人員是非常重要

13、的一個(gè)因素，不同單位很難進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的一個(gè)方面，就是操作人員的專業(yè)素質(zhì)問(wèn)題。如圖四所示跳的高度都不一樣，如果把基線放到不同的位置，結(jié)果就不一樣，因?yàn)橛行┑胤匠霈F(xiàn)穿插。這雖然是不同的反響孔，單孔來(lái)看還是一個(gè)典型的S型曲線。但是熒光PCR定量時(shí)4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或者3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，它是同時(shí)形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成一個(gè)定量的尺度范圍，然后來(lái)定量，因此我們更強(qiáng)調(diào)不同的反響孔放在一塊兒進(jìn)展分析，要求不同的反響孔之間都是平行的，也就是說(shuō)最后應(yīng)該是同樣的一個(gè)效率。圖四為：PCR擴(kuò)增曲線三、質(zhì)量環(huán)節(jié)一核酸提取方法核酸喪失的影響不同單位用購(gòu)置的試劑盒進(jìn)展操作的過(guò)程中，即核酸提取的過(guò)程，是影響質(zhì)量的一個(gè)重要的原因。對(duì)熒光定量來(lái)

14、說(shuō)，標(biāo)本里的核酸量的變化應(yīng)該是唯一量的變化，相應(yīng)的其他過(guò)程不應(yīng)該有量的變化，這才是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。PEG6000 、蔗糖T 等濃縮法：變量多如離心速度及時(shí)間、去上清、裂解液參加量、混勻程度差異等均導(dǎo)致核酸喪失 。如果除了需要檢測(cè)的模板量變，在我們使用過(guò)程中又導(dǎo)致了檢測(cè)的物質(zhì)里的量發(fā)生變化，定量的結(jié)果會(huì)受到很大的影響。核酸提取的方法有好多，目前最常用的是熱裂解的方法。丙肝病毒或甲流H1N1的檢測(cè)常用層析柱，還有目前越來(lái)越流行用磁珠的方法被動(dòng)吸附。TRIZOL 的方法逐漸被淘汰，因?yàn)橐皇撬卸?，二是它喪失的核酸比較多。近幾年又出現(xiàn) 血清直接參加法核酸釋放劑 ，目前主要是有四種：第一是聚乙二醇，即熱裂解法

15、；第二是層析柱的方法；第三是 磁珠提純法；第四是 TRIZOL 沉淀提純法； 第五是 血清直接參加法核酸釋放劑 ，這些方法除了第五種沒(méi)有喪失，但第五種存在把血清加進(jìn)去是不是有干擾物質(zhì)的問(wèn)題，前四種都有核酸的喪失。二 PEG 提取法核酸喪失情況我們對(duì) PEG 提取法核酸喪失情況 做了一些實(shí)驗(yàn)，它的做法是先用100ul裂解液A和100ul的血清混勻，然后高速離心，把上清液去掉，去掉的上清液是不是還有病毒然后把去掉的上清液再做同樣的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)上清液不但有喪失，而且喪失的很多。如圖五所示，2108，4106、1105、1103，四個(gè)不同濃度的血清通過(guò) PEG 提取法 的方法,把離心之后去掉的上清液再做

16、一個(gè)提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅色是上清液檢測(cè)的量，藍(lán)色是原液，相應(yīng)的喪失率分別為5.8%、24.8%、16.0%、16.7%。圖五為 PEG 提取法核酸喪失情況上清去掉后對(duì)沉淀的物質(zhì)參加堿性裂解液進(jìn)展吹打混勻然后煮沸再離心。試劑盒的要求是振蕩混勻，但是把吹打混勻和振蕩混勻的結(jié)果進(jìn)展比照，如圖六左所示：藍(lán)柱是吹打混勻，紅柱是振蕩混勻。吹打混勻得到的量相對(duì)要高一些，可見(jiàn)先吹打再煮沸比簡(jiǎn)單的震蕩混勻要充分的多。因?yàn)檎袷幉荒軐⒊恋淼念w粒完全振開(kāi)，自然裂解就不充分。因此，上清液的喪失，和沉淀顆粒的混勻方式對(duì)結(jié)果影響還是比較大的，從圖上可以看到對(duì)于第次方的喪失率甚至可達(dá)百分之百。圖六為吹打混勻和震蕩混勻的比較三層析

17、柱核酸喪失情況下面對(duì)HCV RNA核酸提取常用的層析柱方法，進(jìn)展研究發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)喪失的步驟。一，標(biāo)本通過(guò)胍鹽裂解后要過(guò)層析柱，過(guò)層析柱后濾下來(lái)的局部液體，里面是否有核酸我們做了連續(xù)4次的過(guò)濾，濾下來(lái)第一濾拿出來(lái)，再濾第二濾，共做四次，然后再分別定量，結(jié)果如圖七所示。濾液一為1.32106，濾液二為3.95105，濾液三1105，濾液四為164。因此可以看出過(guò)濾過(guò)程核酸的喪失程度還是非常嚴(yán)重的。濾完后層析柱通過(guò)洗滌液A、洗滌液B進(jìn)展離心、洗滌，洗滌過(guò)程的喪失這里先不考慮。單看最后一步洗脫過(guò)程，此處要加50ul洗脫液對(duì)層析膜上的核酸進(jìn)展洗脫。第一次加50ul離心洗脫的局部為第一份。然后再加50ul洗

18、出第二份，依次連續(xù)洗四次。最后得出的數(shù)據(jù)和剛剛的 基本一致，也有接近20%50%的喪失。圖七為層析柱核酸喪失情況如果將兩次的喪失疊加，就有近乎80%100%的喪失，當(dāng)然中間還有兩次洗滌還沒(méi)計(jì)算在內(nèi)。由此可見(jiàn)層析柱的方法核酸的喪失是非常明顯的，喪失率為一倍以上。如果標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品的提取是同步進(jìn)展的，那么這種定量的結(jié)果還是具有可比性的。但現(xiàn)在的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品往往是不參與提取的，也就是標(biāo)準(zhǔn)品不喪失，而標(biāo)本卻喪失嚴(yán)重的，這時(shí)要注意，如果標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)WHO定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，那么檢測(cè)到的實(shí)際值應(yīng)該是偏低的。四其他影響因素當(dāng)然對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響還有包括儀器的差異，不同采光的原理、光源的強(qiáng)度。這里要強(qiáng)調(diào)光源的強(qiáng)度，因

19、為熒光PCR儀器是通過(guò)光源照射以后來(lái)激發(fā)檢測(cè)的，那么該光源是有一定壽命的，如果光源使用時(shí)間比較長(zhǎng)，光亮度不夠，那么檢測(cè)的信號(hào)也相應(yīng)會(huì)比較弱一些。這對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，特別是對(duì)弱陽(yáng)性的結(jié)果影響會(huì)比較大。最后還有專業(yè)人員操作的一個(gè)差異也會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。因此對(duì)結(jié)果的影響因素，除了試劑盒的質(zhì)量以外，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、操作人員的素質(zhì)，包括試劑操作方法的差異，都是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。特別是不同的提取方法，如聚乙二醇法、層析柱法和沒(méi)有提到的磁珠法，同樣存在因被動(dòng)吸附引起的喪失的問(wèn)題。而這些都會(huì)影響到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的均一性。哪些因素影響PCR熒光定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、污染與防污染措施大家也許知道1998年時(shí)PCR檢測(cè)技術(shù)在

20、國(guó)內(nèi) 基本上是停用的，主要原因是當(dāng)時(shí)在國(guó)內(nèi)用的比較亂，有些鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院也做PCR檢測(cè)，也可以有一個(gè)跑電泳的房間，通過(guò)電泳結(jié)果來(lái)出臨床報(bào)告。當(dāng)時(shí)很多實(shí)驗(yàn)室做什么試驗(yàn)都是陽(yáng)性的，也就是說(shuō)當(dāng)時(shí)的污染非常嚴(yán)重。因此98年停用以后經(jīng)過(guò)幾年的整頓，衛(wèi)生部要進(jìn)展嚴(yán)格的PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收，同時(shí)進(jìn)展人員培訓(xùn)以及對(duì)試劑逐漸過(guò)渡到熒光PCR，通過(guò)一個(gè)閉管檢測(cè)的方式，大大減少了污染。但是目前污染還是存在，主要原因是核酸提取還是開(kāi)放性的，同時(shí)產(chǎn)物的處理還不嚴(yán)格。更重要的是試劑盒里面的標(biāo)準(zhǔn)品都是陽(yáng)性的模板，有的是質(zhì)粒，有的是合成的序列，有的是血清，不管是怎樣都是陽(yáng)性的物質(zhì)，因此常常也是污染的重要來(lái)源。目前實(shí)驗(yàn)室防污染主要是，一

21、防止核酸提取過(guò)程的外泄；二在試劑配制的過(guò)程中防止標(biāo)準(zhǔn)品的污染；三要防止產(chǎn)物的外泄。實(shí)驗(yàn)室要嚴(yán)格的分區(qū)管理，就是物理隔離，核酸提取和試劑配制不能在一起，試劑配制要盡可能在核酸提取的前方。人員和用的物品要完全不同，就是不要把核酸提取的物品帶到試劑配制室里去。要通過(guò)嚴(yán)格的分區(qū)，工作服和使用器具的更換來(lái)到達(dá)相互不污染的目的。其次，要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，一定要有對(duì)流風(fēng)。有的實(shí)驗(yàn)室為了到達(dá)這個(gè)通風(fēng)，可以安裝排風(fēng)扇。實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)是防污染的非常重要的方法。不要指望把污染物質(zhì)給清掉，而是應(yīng)該把它污染從實(shí)驗(yàn)室趕走。通過(guò)通風(fēng)的方式把實(shí)驗(yàn)室里面的污染物質(zhì)帶走這是最有效的方法。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，最早的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)是一個(gè)閉風(fēng)的狀態(tài)

22、，現(xiàn)在都變成了一種通風(fēng)的狀態(tài)。另外，有效的消毒對(duì)防污染也有作用，不管是提取的核酸還是擴(kuò)增的產(chǎn)物。包括84消毒液，健之素等，都可以對(duì)序列起到破鏈的作用。對(duì)實(shí)驗(yàn)室的操作臺(tái)和其他物品，只要是不怕水，耐腐蝕都要通過(guò)有效氯消毒液進(jìn)展浸泡、擦拭最后清水洗凈的方法來(lái)清潔。通過(guò)一些實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)酒精擦拭或通過(guò)高壓處理的方式都達(dá)不到去除污染的一個(gè)目的。因?yàn)楦邏褐荒馨鸦畹臇|西壓死，對(duì)細(xì)菌滅菌是有效的，但對(duì)序列就很難破鏈。紫外線照射也是如此，雖然對(duì)產(chǎn)物有一定的破鏈作用，但是對(duì)提取的核酸大片斷的破鏈效果還是較差的。最后，人員培訓(xùn)也非常重要，對(duì)于以前沒(méi)有這方面意識(shí)的人員的培訓(xùn)必不可少。不具備防污染意識(shí)的人員盡可能不要操作

23、實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)生污染的原因有哪些如何防止污染的產(chǎn)生五、關(guān)于內(nèi)標(biāo)的討論一實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。1Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期對(duì)數(shù)期，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。2Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)展定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一

24、種采用外標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)本同步進(jìn)展核酸提取的曲線定量方法。二內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的影響假設(shè)在待測(cè)樣品中參加起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，那么PCR反響變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反響中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無(wú)法參加適宜數(shù)量的模板作為內(nèi)標(biāo)。正因如此，定量方法雖然參加內(nèi)標(biāo)，仍為一種半定量方法。美國(guó) Texas 大學(xué)的科研人員進(jìn)展了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。Applied Biosyst

25、ems 公司的 7700 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是全球公認(rèn)的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測(cè)，但定量檢測(cè)仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)展定量。三內(nèi)標(biāo)的失敗率我們對(duì)采用3家公司考核試劑內(nèi)標(biāo)失敗率進(jìn)展分析，3家試劑的內(nèi)標(biāo)均存在內(nèi)標(biāo)失敗的情況，但各不一樣，陽(yáng)性標(biāo)本的失敗率在 3.2%16.5% ；陰性樣本的內(nèi)標(biāo)失敗率在 4%7.2% ，高于 COBAS 的失敗率1.7% ，1/60。摻入內(nèi)標(biāo)的量大多為 5103左右，我們采用 PEG 和直接參加兩種方法對(duì) 2103的 HBV 陽(yáng)性血清進(jìn)展96孔重復(fù)核酸提取，失敗率均為0 。內(nèi)標(biāo)現(xiàn)在有兩類，一類是內(nèi)標(biāo)定量，羅氏 COBAS Taq

26、Man 就是內(nèi)標(biāo)定量，在每管里都有一個(gè)內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)是一定量的，它來(lái)做為一個(gè)定量點(diǎn)，標(biāo)本擴(kuò)增曲線的Ct值和內(nèi)標(biāo)按照3.3的一個(gè)比例關(guān)系來(lái)進(jìn)展內(nèi)標(biāo)定量。另一類是提取內(nèi)標(biāo)，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的內(nèi)標(biāo)都不是定量?jī)?nèi)標(biāo)，而是提取的內(nèi)標(biāo)，也就是在提取的過(guò)程中參加一個(gè)定量的內(nèi)標(biāo)和要提取的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)展提取。對(duì)內(nèi)標(biāo)的要求本應(yīng)是核酸的模板是多少量，內(nèi)標(biāo)應(yīng)該也加多少，做到公平競(jìng)爭(zhēng)。而實(shí)際上要測(cè)的模板的量未知，因此很難做到參加多少內(nèi)標(biāo)。而現(xiàn)在大多數(shù)都參加等量?jī)?nèi)標(biāo)，來(lái)測(cè)不同含量的標(biāo)本里的核酸的量。因此就出現(xiàn)了，比方1106的模板核酸的標(biāo)本，用5103次方的內(nèi)標(biāo)時(shí)，出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)失敗。雖然認(rèn)為污染也不會(huì)污染到1106，但畢竟內(nèi)標(biāo)的失敗也就失去了意義。同樣的實(shí)驗(yàn)