MSC細(xì)胞免疫組化的全過(guò)程

1、細(xì)胞免疫組化全過(guò)程細(xì)胞免疫組化的材料：蓋玻片：18xl8mm2,20 x20mm2；6孑L板（NUNK）,90mm培養(yǎng)皿。載玻片重鉻酸鉀，濃硫酸，超純水，無(wú)水酒精，多聚甲醛，多聚賴氨酸（武漢博仕德，sigma）,彎枕頭lml注射器，消毒的紗布條0.01MPBS液。0.3-0.5%TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚）,DPBS,0.3%也02,5%二抗血清，一抗，熒光標(biāo)記二抗，DAB顯色試劑盒，濕盒，明膠，蘇木素。Hoechst33342（碧云天，10mg,C1022）,5%BSA封閉液試劑配制：1，酸液：重鉻酸鉀：水：濃硫酸=1：2：8；2，0.01%多聚賴氨酸：根據(jù)說(shuō)明書，用塑料器皿

2、進(jìn)行稀釋，過(guò)濾除菌分裝到離心管中。封口膜封閉，4度保存。利用無(wú)菌去離子水稀釋，0.3mlPLL+3ml無(wú)菌去離子水，混勻放入5ml離心管中，封口密封4度存放。3，4%多聚甲醛先配好0.1M的PB1000ml（磷酸二氫鈉2.96g,磷酸氫二鈉28.7g,加雙蒸水至1000ml）然后.稱取40g多聚甲醛,放如廣口瓶中，加入適量的0.1M的PB，搖晃后放入烘烤箱中，用微火加熱60C兩分鐘，然后拿出搖勻，如沒(méi)有熔化，再放加熱兩分鐘，直到融化為止。（瓶子一定要用牛皮紙包好，不然很難聞。一定要用溫火，不要煮沸了。）.冷卻后用濾紙過(guò)濾，最后用0.1M的PB定容至1000ml,既為4%的多聚甲醛。（或者，在1

3、000mlPBS中加入多聚甲醛粉末40g，磁力攪拌器上加熱攪拌，完全溶解后，普通濾紙過(guò)濾，4C保存）4，0.01MPBS:8gNacl,0.2gkcl,1.44gNa2HPO4,0.24gKH2PO4,1L超純水244,5，無(wú)鈣鎂離子的DPBS:0.2gKCL,0.2gKH2PO4,8.0gNacl,1.15gNaHPO4.6，30%TritonX-100儲(chǔ)備液：TritonX-10028.2ml+0.1mol/Lpbs（ph7.3）72.8ml將這兩種液體混合后置入37-40C水浴中2-3h，使其充分溶解混勻。然后置入到4C儲(chǔ)存。使用前用PBS稀釋到所需的濃度0.3-0.5%。使用目的因?yàn)樗?/p>

4、能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的通透性。（由于檢測(cè)的是膜抗原在胞漿內(nèi)表達(dá)，因此不用或者用0.01%tritonx-100）7，0.3%H2O2配制：純甲醇10ml+30%H2O20.1ml,充分混勻即可，使其最終濃度為0.3%?，F(xiàn)用現(xiàn)配，4C保存。（做酶免疫組化用，細(xì)胞免疫組化一般不用）8，細(xì)胞培養(yǎng)液：10%FBS-L-DMEM+100微克/ml青霉素鈉+100微克/ml硫酸鏈霉素。9，細(xì)胞沖洗液：0.01MPBS+500微克/ml青霉素鈉+500微克/ml硫酸鏈霉素10，0.5mol/lPH9.5碳酸氫鹽緩沖液（CB:稱取NaHCO33.7g,Na2CO30.6g加蒸餾水至100ml.溶解后

5、調(diào)PH11，50%緩沖甘油：1份純甘油加1份CB.12，hoechest33342：用0.01MPBS稀釋到0.5-10“g/ml工作濃度。13,DAB顯色試劑盒：A,B,D三種染液使用（詳見說(shuō)明書）14，蘇木素染色15,抗體選擇：一抗：鼠抗CD45,CD105,CD90,二抗羊抗鼠IG?？贵w原液分裝每管20微升，以1:200;1:300;1：400比例進(jìn)行摸索最佳比例。使用前必須要離心。16,5%BSA封閉液：稱取5gBSA用0.01MPBS稀釋。配制時(shí)不可劇烈震蕩，否則會(huì)產(chǎn)生泡沫，先在離心管中加入適量的PBS后，然后加入BSA少量，稍溶解再加入余下的BSA，然后平轉(zhuǎn)BSA離心管，用手握住3

6、-5Min，靜置15min,即可溶解。17，抗體稀釋液:配制成1%或3%BSA-PBS溶液。18，抗熒光猝滅劑。使用之前要進(jìn)行預(yù)溫到室溫19，指甲油，蓋玻片的處理1，爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片；應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時(shí)再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。將剪裁好的爬片，置于濃硫酸重鉻酸鉀液（重鉻酸鉀：濃硫酸：水=1：2：8）中

7、浸泡并過(guò)夜，第二天先用自來(lái)水沖洗20遍，再置于無(wú)水酒清中浸泡6小時(shí)，再用三蒸水沖洗3遍（個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。高壓后取出放入烤箱中烤干，備用?；蚩靖珊罂煞湃氤瑑襞_(tái)中風(fēng)干。，細(xì)胞爬片1，室溫將常規(guī)處理的蓋玻片鋪于培養(yǎng)皿中，用移液槍將0.01%多聚賴氨酸滴加到玻片上，室溫作用lOmin后，用消毒好的紗布條吸去玻片上的多聚賴氨酸工作液，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干次日使用。對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好染色時(shí)不掉片的可以不用防脫片劑處理。2，.第二天加細(xì)胞前，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是

8、使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作，此過(guò)程一定要注意防止產(chǎn)生氣泡。3，然后，進(jìn)行細(xì)胞消化處理，稀釋成1x104/ml接種到六孔板里（或者按2x104/ml接種到9Omm培養(yǎng)皿中）。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話，將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。未取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。，爬片固定及封閉1，將取出的細(xì)胞爬片放入

9、到玻璃小皿中進(jìn)行浸洗，如果進(jìn)行沖洗，也應(yīng)將PBS滴入到玻片上作用2min,再讓PBS自上而下流下來(lái)，一旦組織有飄起更要小心。這樣沖洗3次，各兩分鐘。2，將沖洗后的爬片放入含有4%多聚甲醛（無(wú)水乙醇90ml+40%甲醛10m1）的玻璃皿中，在4C冰箱中固定20-30min.（然后在空氣中干燥5min）3，將固定后的細(xì)胞爬片用37CPBS清洗3次各2min,（清洗方法同上）4，用0.3%-0.5%Tritonx-100（DPBS配制）孵育1次20min,然后用PBS清洗3次每次3min.（此步可以省去）5，用0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫下作用10-15min.此時(shí)應(yīng)該準(zhǔn)備濕盒里面放些

10、水。然后放幾張載玻片做好標(biāo)記，將經(jīng)過(guò)通透及過(guò)氧化物酶封閉后的爬片，用鉤子從6孔板或玻璃皿中勾起。此步驟主要應(yīng)用于酶底物免疫組化，對(duì)于熒光免疫組化可以舍去。6，用PBS清洗標(biāo)本3x3min.然后用濾紙將爬片四周擦干（距離邊緣約1-2mm），然后用組化筆在擦干的區(qū)域迅速畫圈，將爬片放在干燥的載玻片上（注意正反面），濾紙吸干四周時(shí)一定只可吸距離邊緣l-2mm,不可觸及細(xì)胞并不可讓片子干燥。7,用5%二抗來(lái)源的正常血清DPBS液滴入到細(xì)胞爬片上（對(duì)于8mmx8mm玻片，以每片加入50微升，在濕盒中室溫下（37C）封閉爬片作用20min（10-15min）,然后傾去血清，甩去或者吸棄或者用濾紙吸掉血清不

11、可清洗。三,洗滌及染色處理（一）Hochest細(xì)胞核染色及熒光觀察：將已經(jīng)封閉處理的細(xì)胞吸去或甩去多余的液體,然后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的特異性抗體CD45,CD105,CD90的一抗，加到蓋玻片上，放于濕盒中4C冰箱過(guò)夜，拿出后在37C條件下復(fù)溫45min,將復(fù)溫后的一抗玻片，用吸管吸去抗體液，然后用PBS洗滌3x5min.3，將洗滌后的蓋玻片放到盛有載玻片的濕盒上，加入帶有熒光CY3（FITC）標(biāo)記的稀釋后的二抗，避光放置到濕盒中，然后將濕盒放置到恒溫箱中孵育lh,然后用PBS洗滌3x5min,接著用配制好的Hoechest33342避光染色細(xì)胞核，5min,然后用PBS沖洗3次。最后用

12、50%緩沖（0.5mol/l碳酸鹽緩沖液ph9.0-9.5）甘油封固，或者用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封固，之后用指甲油封閉處理。熒光顯微鏡觀察。（二）DAB顯色及蘇木素復(fù)染觀察1，甩去血清后，直接加入稀釋好的一抗，然后放入濕盒中（室溫作用1小時(shí)），然后4C過(guò)夜（至少16-24h）,從冰箱中取出后在37C復(fù)溫45min-60min,加入一抗血清的同時(shí)，最好用DPBS液作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)復(fù)溫后將爬片從載玻片上取下2,吸去一抗用PBS洗3次x5min，濾紙吸濕并置于擦干的載玻片上，然后避光加入已稀釋好的生物素的二抗后放入濕盒中，在37C恒溫箱中30min,然后用PBS清洗標(biāo)本洗3x5min.3，DAB顯色處理

13、（快速加入），在避光條件下在油鏡下觀察顏色，當(dāng)觀察標(biāo)本出現(xiàn)棕色時(shí)（約3-10min），立即倒掉然染液.（DAB配制好的工作液在30min內(nèi)有效，并且要避光存放）4，在含有六孔板或玻璃皿中進(jìn)行浸洗1次5min.終止染色。5,然后蘇木素復(fù)染10min,自來(lái)水洗滌5min6，樹膠封片（直接在載玻片組織上滴加一滴3%明膠封片液（稱取明膠3g,加水40ml,然后加熱至60C，使明膠完全熔解，然后再加入60ml甘油，趁熱用濾紙過(guò)濾，封片時(shí)事先加熱明膠，使其融化），然后將蓋玻片有細(xì)胞的面朝向下朝向載玻片，一手拿住蓋玻片某一拐角，另一手拿對(duì)面拐角，接近封片液錦緞的拐角先降低，直接接觸到液體時(shí)為止，當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接

14、觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，避免產(chǎn)生氣泡）注意事項(xiàng)：1，用過(guò)氧化氫進(jìn)行孵育時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4C避光保存。由于傳統(tǒng)的ABC法和SP法,免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素的干擾，必須用過(guò)氧化氫和卵白素進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般用3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0.3%過(guò)氧化氫則可以適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間，一般1030min；2，血清封閉的目的是組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽(yáng)性；封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BS

15、A、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。一般室溫10-30min。但也要防止封閉過(guò)度。固定的目的是：防止標(biāo)本從玻片上脫落。除去妨礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果。固定劑的選擇一般用4%多聚甲醛。在固定爬片時(shí)，如果用4%多聚甲醛則要固定15min,然后再用37C去離子水將甲醛沖干凈，注意要輕柔，要不然掉片很厲害，在操作過(guò)程中注意玻片的正反面,可以在切割玻片的時(shí)候,在玻片的右上角弄個(gè)缺口,這樣使用的時(shí)候就不會(huì)弄反了。細(xì)胞片的質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗至關(guān)重要,原因很簡(jiǎn)單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無(wú)從談起看,這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力。因?yàn)槊庖邿晒庵行枰玫綗晒饪贵w,因此必

16、須記住避光操作。此外抗體濃度的選擇可能更加重要,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4C或-20C避光保存，以免因標(biāo)記蛋白竭力或熒光減弱而影響結(jié)果。在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下,然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。建議一抗反應(yīng)在4C最佳，反應(yīng)溫和，但時(shí)間最好超過(guò)1624h。8，為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長(zhǎng)時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意：?jiǎn)为?dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合

17、的物質(zhì)。PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱堿性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。9，為了長(zhǎng)期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對(duì)面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不

18、會(huì)產(chǎn)生氣泡。10，有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。11,chemicon公司的一抗一般100微升，價(jià)格2800元效果較好。12，一抗4度孵育后為何要進(jìn)行37攝氏度復(fù)溫：首先為了防止切片從4度直接放入PBS易脫片，其次，使抗原抗體結(jié)合更加穩(wěn)定，一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用。4度和37度時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞幾率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合過(guò)呢趕快，但敏感性也提高了并易引起非特異性染色。13，使用0.3%過(guò)氧化氫一般作用10-30min,用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易引

19、起脫片.現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。14,PBS清洗方式選擇，次數(shù)及時(shí)間選擇：?jiǎn)为?dú)沖洗，如果在加入一抗孵育完后，將它們?cè)谝粋€(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒(méi)有相互交叉污染的機(jī)會(huì)；溫柔沖洗，防止切片的脫落，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無(wú)需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS,持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。在免疫組織化學(xué)的染色過(guò)程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過(guò)酸或偏堿

20、，都將影響染色的結(jié)果。H即理根虹肖匸檢亡曠篇色心粧化現(xiàn)躲職I州1+Hifii-存戒拓理沖滋戌9A%；車哉綸過(guò)念血滋酣（歐竝松扛飆施此血抵利缽尊門彳務(wù)相蚩善于ri壽此邊碌小心底,2-授喙TOC o 1-5 h z，。將M帝前于我壽出衛(wèi)癘-:朮:_J-型灌玉u陰$灌況兇！.誇製，亠殆;黃”二_A!LJbJ.2）朋播*一.畀仇人沐押皿虧乖祈務(wù)兎緬松次（菽魏I.電蟲我薊轡4包桶懇的）亠.：|號(hào)”底靈甘呼笳，階八3國(guó)屈龜|瘵怎囤遼比沁t_.I4咂玄因免很鬼如3誌科2込社_IWi*iH）梵啟良施M南r二籃訶冋痕了m莎仙|小曲丄才躍鷗aI譙噱1%弓Qee（滋才彳譜&產(chǎn)p璉理知M1總為怙磯耳巾灣I盅也5翩啜1

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24、ith4%paraformaldehydefor15minutes,washed,andthenblockedingoatorrabbitserumfor1hourat37C.(:皂Ils樂(lè)皂匸亡incubatedwithvariousprimaryantibodies(Table1)for24hoursat4C(negativeandpositivecontrolsweremadesimultaneously),followedbysecondanyantibodies(fluoresceinisothiocyanateFITCortetraethylrhodamineisothiocyanateTRITCconjugated)for1hourat37C.Finally,nucleiwerecounterstainedwithHoechst(1:1000)for10minutesarroomtemperature.Thecellswerevisualizedusingafluoresc皂ntmicroscope(Ol