梁超-綠康-抗菌肽物質與小豬下痢

1、抗菌肽物質與預防小豬下痢(文獻綜述)綠康生化股份有限公司梁超博士2013年6月20日 上海1報告人簡介姓名: 梁超職務: 質量與法規(guī)總監(jiān) (綠康生化股份)學歷: 博士(美國堪薩斯州立大學) 經歷: 美國建明工業(yè)公司 （亞洲區(qū)技術總監(jiān)）美國雅來大藥廠 （中國區(qū)總經理）泰國正大生化集團 （技術顧問 ）美國微營養(yǎng)公司 (亞太區(qū)總經理) 論文: 30多篇專利: 5件2抗菌肽是有抗菌活性的肽類化合物(馬衛(wèi)明,2004)。已有1000多種抗菌肽物質被研究。中文報告多達4-8000份,而英文論文則接近40萬份。 有報告指出我國仔豬全年平均發(fā)病率46.5%, 因下痢致死亡率為 10.3%, 是影響中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)

2、展的重要因素之一 。本文是抗菌肽物質和小豬下痢有關的文獻綜述。34( 馬衛(wèi)明, 2004, 中國農業(yè)大學博士論文) （ 同時具有抗菌特點及肽結構這兩種性質的物質 = “抗菌肽”“肽結構” = 幾至幾百個氨基酸呈線性或環(huán)狀聚合物抗菌肽研究概述 (1000多種抗菌肽物質)生物來源抗菌肽舉例氨基酸數量已報道的種類文獻哺乳動物防御素類18 - 42100多種陸婕, 2005鐘雅, 2007 馬衛(wèi)明, 2004陳紹峰, 2003 朱伶俐, 2012 Mukesh Pasupuleti, 2009Catheliodins 類140 - 300600多種乳鐵蛋白69050多種溶菌酶12920多種兩棲動物蛙皮

3、素1430多種鈴蟾肽1420多種微生物桿菌肽124種多粘菌素9-113種HIV-1抗菌肽121種植物植物防御素類20 - 93100多種昆蟲天蠶素類31 - 3920多種昆蟲防御素類30 - 60100多種富脯氨酸類15 34100多種富甘氨酸類100 - 200100多種5抗菌肽與小豬下痢母豬奶水中的乳鐵蛋白腸膜蛋白及其抗菌肽物質微生物源抗菌肽桿菌肽硫粘菌素基因工程抗菌肽溶菌酶天蠶素結論6Lactoferrin (乳鐵蛋白) 1959年Groves用色譜得到純的紅色的含鐵的糖蛋白乳鐵蛋白在人乳中的濃度為1.0-3.2mg/ml，是普通牛乳中的10倍（牛乳中含量為0.02-0.35mg/ml）

4、,而人初乳中乳鐵蛋白可達6-14mg/ml. 一般推測, 其他哺乳動物的初乳中的乳鐵蛋白也很高乳鐵蛋白對鐵離子的吸附性超強, 一般認為它可以奪走細菌生長所需的鐵質而抑制細菌的生長，達到防治下痢的效果。78鐵離子對母豬奶水中下痢細菌生長的影響Growth in 12 hrs (Colony forming units)O157 E. coli Clostridium perfringens Salmonella typhimurium*102104*1.251.5*FeFeFeKlasing & Knight, 197910( 盧蓉蓉 等, 2008) LF = 乳鐵蛋白11( 楊安樹 等, 2

5、007) 12( 黎觀紅, 等, 2009 ) 13( 侯振平 等, 2011 ) Liang 等(1993) 報道了人 乳鐵蛋白在啤酒酵母中的表達, 然后通過酵母轉化酶分泌信號序列將重組人乳鐵蛋白分泌至細胞外, 產率為 15 -20 mg/L。Ward 等(1992)把合成乳鐵蛋白的遺傳信息轉移到曲霉菌中, 然后在適宜條件下進行培養(yǎng), 從而實現了乳鐵蛋白的優(yōu)化生產, 這是通過發(fā)酵大量生產乳鐵蛋白的重大突破。14乳鐵蛋白的轉基因表達圍產期中，提高母豬健康，保證乳鐵蛋白數量和質量在母豬產前14天至產后21天，母豬飼料中添加 250ppm MDAB(必恩迪), 能有效防治由產氣莢膜梭菌引起的乳豬腸

6、炎 。（美國 FDA法規(guī) ， 21 CFR Ch. I 558.76, )15小結 1豬母乳含有豐富的乳鐵蛋白, 是預防仔豬下痢的“抗菌肽”最佳來源在母豬圍產期(產前-產后)的母豬飼料中使用抗菌肽產品能減少仔豬下痢現象, 有可能是母豬健康保證了奶水質量和乳鐵蛋白抗菌肽含量的結果16抗菌肽與小豬下痢母豬奶水中的乳鐵蛋白腸膜蛋白及其抗菌肽物質微生物源抗菌肽桿菌肽硫粘菌素基因工程抗菌肽溶菌酶天蠶素結論17豬小腸中抗菌肽研究成果舉例18研究者年代抗菌肽分子量Lee1989Cecropin P13339 DaAgerberth1991PR-394719 DaAndersson1995NK-lysin89

7、24 Da周洪福1995乙酸提取物馬衛(wèi)明2004乙酸提取物5972 Da（馬衛(wèi)明， 2004,中國農業(yè)大學博士論文) 19( 趙燕飛 等, 2005 ) 20( 王春維,2005 ) 21( 徐軍等, 2006 )腸膜蛋白對教槽料的影響22腸膜蛋白( 司馬博鋒 等, 2011)小結 2豬腸膜抗菌肽開發(fā)還處于研究階段. 使用豬腸膜粉(加工后副產品)作為腸膜抗菌肽來源養(yǎng)豬對防治仔豬下痢有一定的效果直接使用腸膜粉(抗菌肽)存在生物安全問題通過基因工程菌生產腸膜抗菌肽仍需研究 23抗菌肽與小豬下痢母豬奶水中的乳鐵蛋白腸膜蛋白及其抗菌肽物質微生物源抗菌肽桿菌肽硫粘菌素基因工程抗菌肽溶菌酶天蠶素結論24細

8、菌源抗菌肽的比較品種產生菌停藥期抑菌機理抗菌譜FDA法規(guī)用藥成本桿菌肽地衣芽孢菌0 細胞壁合成G + 低硫粘菌素多粘桿菌7細胞膜合成G -低維吉尼霉素鏈霉菌1蛋白質合成G + + 較高恩拉霉素放線菌7 細胞壁合成G + -中等那西肽放線菌3 蛋白質合成G +-中等地衣芽孢菌是全球幾十個國家所批準使用的益生菌（直飼微生物）25FDA法規(guī)尚未批準硫粘，恩拉和那西肽作為飼料中長期添加的藥物桿菌肽與硫粘菌素簡介抗菌肽名稱桿菌肽硫粘菌素/多粘菌素化學結構化學性狀地衣芽孢桿菌多粘芽孢菌抗菌譜革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌作用機理抑制細菌細胞壁合成破壞細菌細胞膜中和細菌內毒素26桿菌肽的抑菌機理及其與其它抗菌

9、素的區(qū)別27( Smith & Weinberg, 1962) 桿菌肽對動物結腸中產氣莢膜梭菌的抑制作用桿菌肽 (ppm)動物結腸中產氣莢膜梭菌(CFU/g 腸糜）病源菌減少倍數0800,00001790,0001:164,000200:1175001600:1553002666:128( Stutz, et al., 1983) 29( Nurmi & Rantala, 1974 )兩種桿菌肽產品的理化差異30美國 FDA關于桿菌肽的法規(guī) ( 21 CFR Ch. I 558.76, )桿菌肽鋅亞甲基水楊酸桿菌肽 (MDAB, 必恩迪) 肉雞, 活雞 和 山雞的促生長 (4 to 50 g/

10、ton) .肉雞, 火雞 和 山雞的促生長 (4 to 50 g/ton) .和金霉素配合使用, 治療細菌性腸炎, 細菌性肺炎和增生性回腸炎 (50克/噸MDAB + 400克金霉素/噸，連續(xù)14天）治療壞死性腸炎 (50 -200 ppm)，豬痢疾（250ppm)由產氣莢膜梭菌引起的乳豬腸炎 （在母豬產前14天至產后21天，母豬飼料中添加 250ppm)31亞甲基水楊酸桿菌肽國家五類新獸藥 具有“生產許可證”、“獸藥添字文號” 成分確定，效果明確, 暫無耐藥菌株商品名: “必恩迪”( 含量: 15% )該產品的研究報告有: 8000多份 /scholar?hl=zh-CN&q=Bacitra

11、cin+methylene+disalicylate&btnG=&lr=3233( 陳紹峰, 2003 ) ,南京農業(yè)大學碩士論文硫粘菌素對內毒素的中和作用34( Cooperstock, M. S., 1974)鱟試劑反應 呈陰性35( 牛志強, 2011 ) 36處理 1 組：60 ppm 鹽霉素，+ 20 ppm 進口硫酸粘桿菌素處理 2 組：60 ppm 鹽霉素，+ 20 ppm 國產硫酸粘桿菌素（王寧， 2005 , 中國農業(yè)大學碩士論文） 37（趙志杰等, 2012 ）小結 3桿肽和硫粘是最常使用在仔豬料中的抗菌肽獸藥添加劑, 效果明顯和安全由于農業(yè)部法規(guī)限制,目前在仔豬飼料中的使

12、用受到影響. 需要研究更好的使用方式(如配伍等) 及探討申請預防仔豬下痢的”專用配方”38抗菌肽與小豬下痢母豬奶水中的乳鐵蛋白腸膜蛋白及其抗菌肽物質微生物源抗菌肽桿菌肽硫粘菌素基因工程抗菌肽溶菌酶天蠶素結論3940( 朱伶俐, 2012 , 江南大學碩士論文 ) 溶菌酶抗菌肽(Lys-Pe)對不同菌種的抑菌情況41( 朱伶俐, 2012 , 江南大學碩士論文 ) 42( 邵春榮 等, 1996 ) ( 溶菌酶制劑由雞蛋清經鹽析、凍干后制成,每毫克含溶菌酶1500單位。 ) 43 ( 邱偉海, 2006 ) 44( 朱軍英, 2009 )45( 張鋒,2006, 山東農業(yè)大學碩士論文) ( 開食

13、料中添加溶菌酶可溶性粉劑（5000IU/mg），每 100kg 飼料中添加 10、5.0、2.5g；傳統(tǒng)藥物對照組每 100kg 飼料中添加強力霉素 200g；空白對照組不添加任何藥物 ) 46( 網絡資訊 )小結 41）轉基因溶菌酶的安全性如何保證？ 2）過多的溶菌酶是否干會擾內源溶菌酶的產生和分泌？部分人體對溶菌酶有過敏現象(付 琴等, 2012) , 是否有部分仔豬也會有過敏問題 ?47天蠶素1975 年瑞典科學家G.Boman 等人從惜古比天蠶(Hyatophoracecropia)蛹中誘導分離得到一種殺菌肽，并將其命名為cecropin（天蠶素）。目前已經在多種生物中發(fā)現了大約有 9

14、0多 種天蠶素基因。天蠶素抗菌肽 是根據 cecropin A 和 cecropin6D 設計合成的含 37 個氨基酸殘基的雜合肽, 在枯草芽孢桿菌中成功表達的基因工程產物( 王阿榮, 2011, 內蒙古農業(yè)大學碩士論文 ) 中國知識網上有270多篇關于天蠶素的研究論文48天蠶素抗菌肽在斷奶仔豬飼糧中的應用效果49（溫劉發(fā) 等， 2001 ） 天蠶素抗菌肽由華南農業(yè)大學蠶業(yè)服裝系黃自然教授提供,其活性為4000單位/g。50溫劉發(fā)等， 2007。 廣東蠶業(yè) 41( 1) : 39- 42抗菌肽組按 2ml/kg 飼料或 0.5ml/kg 飼料的劑量?？股亟M按強力霉素 150mg/kg 及阿散

15、酸 100mg/kg 的劑量, 混合后飼喂仔豬。51( 黃亞東 等, 2002 )“天蠶素抗菌肽”對斷奶仔豬生長性能和免疫效果的影響52（ 戴求仲, 2012 )53( 李永新, 2009 ) 54( 王阿榮, 2011, 內蒙古農業(yè)大學碩士論文 ) 試驗 I 組: 180 g/t 的天蠶素抗菌肽試驗 II 組: 250 g/t 的天蠶素抗菌肽試驗 III 組: 320 g/t 的天蠶素抗菌肽55( 杜淑環(huán), 2012 )小結 5天蠶素抗菌肽的效果是明顯的, 但其產品定位尚不明確: 新獸藥? 新飼料原料 ?轉基因產品的安全性問題/Essay/food/201203/263364.shtml56

16、抗菌肽與小豬下痢母豬奶水中的乳鐵蛋白腸膜蛋白及其抗菌肽物質微生物源抗菌肽桿菌肽硫粘菌素基因工程抗菌肽溶菌酶天蠶素結論57被用于防治小豬下痢的抗菌肽舉例物質名稱( 來源 )氨基酸數量抗菌譜機理參考文獻乳鐵蛋白(奶)690廣譜 消除鐵離子( 楊安樹 等, 2007) ( 盧蓉蓉 等, 2008) 溶菌酶 (雞蛋清)129G + 水解胞壁糖甘鍵李鶴 等, 2007天蠶素 (蠶)39G -破膜王阿榮, 2011PR-39 (豬小腸)39G -破膜徐軍等, 2006粘桿菌素(細菌)10G - 破膜陳紹峰, 2003 桿菌肽鋅(細菌)12G + 破壁 Stutz, et al., 198358獲得免疫與固

17、有免疫的比較 *獲得免疫固有免疫存在僅高等脊椎動物所有生物反應啟動時間數天數小時專一性非常多樣化有限和固定對重復感染的反應速度比初次反應更快與初次反應一樣對外來病源的記憶有無種系編碼無有成分舉例抗體, 抗原, 白細胞，T淋巴細胞，B淋巴細胞單核細胞, 等抗菌素,抗菌肽,細胞因子,補體成分,吞噬細胞, 等59（Mukesh Pasupuleti, 2009, 瑞典 Lund 大學博士論文 )( * 以下認知截止到目前而已 ! ) 基因工程抗菌肽的問題活性：基因工程抗菌肽活性不穩(wěn)定毒性：有強烈的腎毒性功能與結構：尚需要研究體內穩(wěn)定性：可能被胰蛋白酶水解耐藥性：長期使用也會產生法規(guī)：暫是還沒有被“正式批準”作為飼料60（韓文瑜,孫長江， 2009 ）61/n/2013/0618/c183342-18882163.html預防下痢“抗菌素替代物”分析 62類別有效成分主要缺點其他問題有機酸苯甲酸, 山梨酸, 丙酸鹽, 富馬酸二甲酯需要高劑量腐蝕性, 刺激性植物提取物大蒜及其提取物, 桂皮提取物, 牛至油需要