008免疫熒光觀察細胞骨架實驗

1、免疫熒光技術觀察腫瘤細胞骨架根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術測定含量。 實驗原理：異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC） 呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。最大吸收光

2、譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為520530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為389.4。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個Ig分子上最多能標記1520個FITC分子。人宮頸癌上皮細胞 爬片（HeLa）多聚甲醛固定液配法：稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸緩沖液（Phosphate Buffer以下簡稱PB），加熱至60左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少許1n NaOH才能使溶液清亮，最后補足0.1mol/L的PB于1000ml，

3、充分混勻 透化試劑： 950ml 0.1M PBS中加入20TritonX-100母液50ml（終濃度為0.5%）20TritonX-100母液（10）：180ml PBS中加入 20ml TritonX-100 至完全溶解 20Tween-20母液（2）：10ml PBS中加入0.2ml Tween20腫瘤細胞及實驗試劑：一抗：小鼠抗人-actin多克隆抗體，用時稀釋了200倍。二抗：羊抗鼠免疫球蛋白（FITC標記），用時稀釋60倍 一抗稀釋液：1ml PBS中加入0.02g牛血清白蛋白（BSA）粉末，溶解后加入20Tween-20母液2550l（終濃度0.05%0.1）。二抗稀釋液：配法同

4、一抗?？贵w準備1去除35mm Dish 中的培養(yǎng)基，用1ml PBS中洗一次，去除PBS；2多聚甲醛固定液中室溫固定20min；3. 將爬片放入35mm Dish（鋪好濾紙）中，在其上滴加50ul含0.5% TritonX-100的PBS，室溫透化20min；4吸去透化液，加200ul PBS清洗3次，每次3min；5用鑷子小心將蓋玻片夾起，用濾紙吸干水分，放入事先鋪好濾紙，并用PBS浸濕的一新35mm Dish中間，滴加80ul 2BSA封閉液，室溫溫育20min；6用濾紙上吸至半干；7滴加30 ul一抗稀釋液至細胞表面， 37恒溫箱中溫育60min；9PBS洗三次，每次10min（搖床中進行）；10. 滴加50ul熒光標記的二抗室溫溫育60min（避光）；11PBS洗三次，每次3min（搖床中進行）；12. DAPI 50ul染色5 min ，PBS漂洗1min；13濾紙上吸干玻片上殘余的液體，在干凈載玻片上滴一滴封固劑（10ul），細胞面朝下蓋于封固劑上，在載玻片上貼好，趕走氣泡；14避光保存待觀察。實驗步驟：預備實驗結(jié)果HeLa c