免疫熒光檢測(cè)

1、免疫熒光技術(shù)（檢測(cè)抗核抗體（ANA）的實(shí)驗(yàn)方案）熒光免疫技術(shù)是以熒光物質(zhì)標(biāo)記的特異性抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于相應(yīng)抗原或抗體的分析鑒定和定量測(cè)定。熒光免疫技術(shù)包括熒光抗體染色技術(shù)和熒光免疫測(cè)定兩大類。熒光抗體染色技術(shù)是用熒光抗體對(duì)細(xì)胞、組織切片或其他標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行鑒定和定位檢測(cè)，可在熒光顯微鏡下直接觀察結(jié)果，稱為熒光免疫顯微技術(shù)，或是應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行自動(dòng)分析檢測(cè)，稱為流式熒光免疫技術(shù)。熒光免疫測(cè)定主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定和熒光偏振免疫測(cè)定等。本次實(shí)驗(yàn)以熒光免疫顯微技術(shù)檢測(cè)抗核抗體（ANA）為例進(jìn)行實(shí)習(xí)?？购丝贵w（antinuclearantibody,ANA）又稱抗核酸抗原抗體，

2、是一組將自身真核細(xì)胞的各種成分脫氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作為靶抗原的自身抗體的總稱，能與所有動(dòng)物的細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)，主要存在于血清中，也可存在于胸水、關(guān)節(jié)滑膜液和尿液中?？购丝贵w實(shí)驗(yàn)原理以小鼠肝細(xì)胞或某些培養(yǎng)細(xì)胞（如Hep-2）作抗原片，將病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就會(huì)與細(xì)胞核成分特異性結(jié)合。加入熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體又可與ANA結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核部位呈現(xiàn)熒光。試劑與器材1抗原片現(xiàn)多用商品試劑。如需自行制備，方法如下：肝印片制備：取4-8周齡小鼠，斷頸殺死后，剖腹取肝。將肝臟剪成平面塊，用生理鹽水洗去血細(xì)胞，用濾紙吸干滲

3、出的漿液。將切面輕壓于載玻片上，使其在載玻片上留下薄層肝細(xì)胞。冷風(fēng)吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。Hep-2細(xì)胞抗原片制備：Hep-2細(xì)胞是建株的人喉癌上皮細(xì)胞。經(jīng)適宜培養(yǎng)在載玻片上形成單層細(xì)胞抗原片，用洗滌洗去培養(yǎng)基。干燥后，用無水乙醇固定。肝切片制備：取小鼠肝組織作冰凍切片，厚4l。-30C保存?zhèn)溆谩?異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人IgG抗體(FITC-抗人IgG抗體)有商品供應(yīng)，臨用時(shí)按效價(jià)稀釋。3.LPBS4緩沖甘油取甘油9份加PBS1份。待測(cè)血清、陽性和陰性對(duì)照血清臨床標(biāo)本篩選獲得。6器材熒光顯微鏡、孵箱、有蓋濕盒、染色缸、吸管、試管等操作方法1準(zhǔn)備：檢查加樣板，生物載片恢復(fù)室

4、溫，標(biāo)記。2稀釋：PBS-Tween緩沖液稀釋血清，設(shè)陰陽性對(duì)照。3.加樣：加樣板放于泡沫塑料板上，加25ul稀釋后血清，至加樣板的每一反應(yīng)區(qū)，避免氣泡。加完所有標(biāo)本后開始溫育。4溫育：將生物薄片蓋于加樣板的凹槽里，反應(yīng)開始，室溫溫育30分鐘。5沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然后立即將其浸入盛有PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。6加樣：滴加20ul熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白(結(jié)合物)至一潔凈加樣板的反應(yīng)區(qū)，完全加完方可繼續(xù)溫育。熒光素標(biāo)記的抗人球蛋白用前需混勻并以PBS-Tween緩沖液稀釋。7沖洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液流水沖洗生物薄片，然

5、后立即將其浸入盛有PBS-Tween緩沖液的小杯中至少1分鐘。不必混搖。8.封片：將蓋片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至蓋片：每反應(yīng)區(qū)約10ulo從PBS-Tween緩沖液中取出1張生物薄片，用紙擦干背面和四邊。還要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將生物薄片面朝下放在已準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即查看并調(diào)整使蓋片嵌入載片的凹槽中。然后繼續(xù)下1張。結(jié)果判定熒光顯微鏡下觀察1細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽性染色細(xì)胞為ANA陽性，否則為陰性。陽性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。2根據(jù)細(xì)胞核著染色熒光的圖像，可區(qū)分為：均質(zhì)型：細(xì)胞核呈均勻一致的熒光；周邊型（核膜型）：細(xì)胞核周

6、圍呈現(xiàn)熒光；斑點(diǎn)型（顆粒型）：細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光；核仁型：核仁部分呈現(xiàn)熒光。混合型：兩種以上核染色；應(yīng)用細(xì)胞片做抗原片可檢出著點(diǎn)型（ACA）注意事項(xiàng)1.PBS-Tween緩沖液在4C下可存放兩周。2根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本量決定需要稀釋的FITC標(biāo)記的抗人球蛋白的量，稀釋后可在4C下可存放1周。3血清或FITC標(biāo)記的抗人Ig應(yīng)滴加至加樣板上，不能直接滴到載片上。4載片蓋到加樣板上后，確保反應(yīng)區(qū)與液滴完全接觸后，才開始記時(shí)溫育。5沖洗載片時(shí)水流要緩慢，以免沖洗掉基質(zhì)。載片上的反應(yīng)區(qū)應(yīng)保持濕潤，不要將載片風(fēng)干。封片進(jìn)不可用力擠壓蓋玻片，以免損壞基質(zhì)。可左右挪動(dòng)蓋玻片以使其正確嵌入載片凹槽里。封片介質(zhì)

7、含有熒光穩(wěn)定劑，應(yīng)保存在2-8C。封好的載片可于4C長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)討論方法評(píng)價(jià)間接免疫熒光技術(shù)是檢測(cè)ANA最常用的方法。該方法簡(jiǎn)便、敏感，且可根據(jù)核染色形態(tài)確定核抗原的類型。鼠肝印片細(xì)胞分布不均勻，多有重疊，沖洗時(shí)易丟失。Hep-2細(xì)胞具有核大、有絲分裂旺盛、核內(nèi)細(xì)胞器較明顯、具備人源性抗原的特征，對(duì)診斷和鑒別不同類型的自身免病十分有利。檢測(cè)抗核抗體(ANA)的實(shí)驗(yàn)方案ANA簡(jiǎn)介抗核抗體(antinuclearantibodies，ANAs)經(jīng)典定義：針對(duì)細(xì)胞核成分的一大組抗體譜?？购丝贵w新概念(FANA)傳統(tǒng)定義：顧名思義是指抗細(xì)胞核抗原成分的自身抗體的總稱狹義定義現(xiàn)代定義：是指抗細(xì)胞內(nèi)所有

8、抗原成分的自身抗體的總稱。對(duì)ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸（nucleicacid）和核蛋白（nucleoprotein）抗體的總稱廣義定義靶抗原分布：細(xì)胞核細(xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞分裂周期抗核抗體檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體“金標(biāo)準(zhǔn)”一IIFANA檢測(cè)方法進(jìn)展：僅限于IIF改良法（底物選擇、制備方法）試圖將ELISA發(fā)推廣為最基本的篩選方法未獲成功復(fù)制細(xì)胞抗原全部成分極其困難抗原存在的相對(duì)濃度、自然抗原決定簇的二級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)熒光染色模型可初步判斷相應(yīng)抗體性質(zhì)范圍或確定抗體特異性IIF法：HEp-2細(xì)胞底物（90%以上實(shí)驗(yàn)室采用）#完整的ANAs抗原譜（細(xì)胞核、漿、骨

9、架、周期）#可預(yù)測(cè)分析ANA靶抗原范圍#經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)ELISA法：采用高度純化抗原或全細(xì)胞抗原#抗原譜有限（十余種）#假陰性結(jié)果#操作簡(jiǎn)單快速其他方法：金標(biāo)法、比濁法ANA靶抗原多核苷酸：雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA組蛋白：Hl,H2A,H2B,H3,H4,H2A-H2B復(fù)合物核漿的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核點(diǎn)、增殖性細(xì)胞核抗原核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纖維蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心(NOR)核膜抗原：板層素(層粘連蛋白)著絲點(diǎn)：著

10、絲點(diǎn)蛋白ANA檢出率與年齡和性別有關(guān)與個(gè)體的免疫穩(wěn)定性相關(guān)使用足夠敏感的方法，每個(gè)人都可檢測(cè)出一些ANA。天然ANA生理性自身免疫維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的生理穩(wěn)定。滴度較低，親和力弱，大多為IgM型。ANA檢測(cè)方法初篩抗核抗體：IIF最佳基質(zhì)：聯(lián)合生物薄片（HEp-2細(xì)胞/猴肝冰凍組織）區(qū)分抗核抗體的靶抗原：ELISA、印跡法和免疫印跡法ANA初篩IFT：HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟完整的抗原譜（細(xì)胞核及細(xì)胞漿）可預(yù)測(cè)靶抗原協(xié)助檢測(cè)其它項(xiàng)目（如ANCA、ENA）ELISA：采用高度純化的抗原初篩ANA抗原譜有限操作簡(jiǎn)單快速采用滴定平板技術(shù)進(jìn)行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)為了使實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化，歐蒙開發(fā)了滴定平板技術(shù)：

11、滴加標(biāo)本或標(biāo)記抗體至加樣板的反應(yīng)區(qū)，然后將生物薄片載片蓋在加樣板表面的凹槽里，這時(shí)，載片上的所有生物薄片均與液滴接觸，反應(yīng)同時(shí)開始。系統(tǒng)的幾何結(jié)構(gòu)決定了液滴的位置和高度。因?yàn)橐后w被局限在一封閉的空間里，所以不再需要傳統(tǒng)的“濕盒”。并且可在一致的反應(yīng)條件下同時(shí)溫育任何數(shù)量的標(biāo)本。準(zhǔn)備：檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑或ExtranMA01（默克公司），再用水徹底沖洗。需要消毒時(shí)，可于3%的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時(shí)。只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。稀釋：按照試劑盒使用說

12、明稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽性和陰性對(duì)照。對(duì)照血清使用前必須混勻。加樣：在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積：10M/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）25Ml/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）70Ml/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）溫育：將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫溫育30分鐘。清洗：用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘加樣：將熒光標(biāo)記的抗人免疫球蛋白（酶

13、結(jié)合物）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個(gè)載片）。使用連續(xù)加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。加樣體積：10M/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）20Ml/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）60Ml/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）溫育：從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽光直射載片。室溫溫育30分鐘。清洗：用燒杯

14、盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴（150M）伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。沖洗1秒鐘小杯內(nèi)浸洗5分鐘封片：在蓋玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進(jìn)行下一個(gè)載片的操作。封片體積：10M/反應(yīng)區(qū)（3x3mm）10M/反應(yīng)區(qū)（5x5mm）20Ml/反應(yīng)區(qū)（7x9mm）結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下

15、觀察熒光。具體操作熒光工作臺(tái)的布置清洗載片的擦拭封片可篩查上百種不同的抗ANA的結(jié)果間接免疫熒光法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)（一種基質(zhì)體）用HEp-2細(xì)胞檢測(cè)自身抗體ANA熒光模型核均質(zhì)型核仁型核顆粒型胞漿型ANA確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（1）IFT:-HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：特殊的熒光模型如著絲點(diǎn)、核膜型、核糖體P蛋白、肌動(dòng)蛋白ELISA:-ANA分項(xiàng)（含ENA譜）：包被高度純化抗原斑點(diǎn)法/印跡法-ENA譜:采用各種高度純化的抗原ELISA：抗ENA譜印跡法：抗ENA譜印跡法：抗ENA譜免疫印跡法ANA確認(rèn)實(shí)驗(yàn)（2）Westernblot:HEp-2細(xì)胞提取物定性適宜特別需要（如區(qū)分靶抗原Ro52或Ro60）檢測(cè)目前無

16、法純化的靶抗原的抗體（如PM-Scl、Ku）結(jié)論初篩實(shí)驗(yàn)：免疫熒光技術(shù)（HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟）ELISA（純化的多種核抗原）確認(rèn)實(shí)驗(yàn)：ELISA印跡法斑點(diǎn)法WesternblotANA譜與相關(guān)疾病相關(guān)疾病的ANA譜ANA的各種熒光模型、靶抗原及相關(guān)性高滴度的ANA僅出現(xiàn)在自身免疫性疾病中自身免疫性疾病ANA陽性率(%)系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)期95-100非活動(dòng)期80-100藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡混合性結(jié)締組織100病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)100炎20-40SSA20-60SSB10-20Ku5-1020-40心磷脂、b2-GPl抗細(xì)胞抗體熒光模型(immunofluorescentpattern)常見的熒

17、光染色模型有6種：核均質(zhì)型(homogeneouspattern，H)核顆粒型(Granuloguspattern，S)核仁型(nucleouspattern，N)核膜型(membranouspattern，M)著絲點(diǎn)型(centromertpattern，ACA)胞漿型(cytoplasmicpattern，ACYA)HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：核均質(zhì)型ssDNA/dsDNA靶抗原：?jiǎn)捂?、非天然DNA(嘌吟和嘧啶鹼基對(duì))雙鏈、天然DNA(脫氧核糖核酸結(jié)構(gòu))相關(guān)性:ssDNA類風(fēng)濕SLE干燥綜合征皮肌炎類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎獻(xiàn)血員SLE%30%90%抗dsDNA:綠蠅短膜蟲組蛋白靶抗原：組蛋白Hl、H

18、2A、H2B、H3、H4（主要抗原H1和H2B）功能：形成核小體相關(guān)性：藥物誘導(dǎo)性LE:100%（唯一的標(biāo)志抗體）SLE：40%-80%其它風(fēng)濕性疾病：少見HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗RNP/SmUl-nRNP靶抗原：與Ul-nRNA連接的3個(gè)蛋白分子（70K、A和C蛋白）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：MCTD:95%100%SLE:15%-40%抗Sm抗體靶抗原：與U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA連接的6種不同蛋白分子（coreproteinsB,B,D,E,F,G）功能：切割pre-mRNA相關(guān)性：SLE:5%30%HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗核糖體P蛋白抗核糖體P蛋

19、白抗體抗原：核糖體的亞單位（60S）,3個(gè)蛋白分子組成：P0、P1、P2（38、19、17kDa）。在碳末端具有相似的免疫反應(yīng)表位。功能：蛋白合成易位過程中的輔蛋白相關(guān)性：SLE：5%15%原發(fā)性干燥綜合征的抗體譜靶抗原陽性率（%）SSA4095SSB40954095ssDNAHEp2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗SSA/SSB抗SSA抗體靶抗原：與Yl,Y3,Y4或Y5型RNA連接的2個(gè)蛋白（52kDa和60kDa）功能：調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯活性相關(guān)性：干燥綜合征：40%95%SLE:20%60%抗SSB抗體靶抗原：與小分子RNA（U6RNA,pretRNA）結(jié)合的磷脂蛋白（48kDa）功能：RNA多聚

20、酶III的輔蛋白相關(guān)性：干燥綜合征：40%95%SLE:10%20%進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化征的抗體譜靶抗原性率（）著絲占八、80-95Scl-7025-75ssDNA30-60原纖維蛋白5-10RNA聚合酶4PM-Scl（重疊綜合征）3NOR-90（核仁形成區(qū)）少見Ku（多肌炎型重疊綜合征）1-7HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗著絲點(diǎn)抗體抗著絲點(diǎn)抗體靶抗原：連接動(dòng)粒（著絲點(diǎn)）上的4個(gè)蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa）主要的靶抗原：著絲點(diǎn)B蛋白（與IIFT相關(guān)性：100%）功能：與紡錘體纖維連接相關(guān)性：硬皮?。?8%局限性硬化征（CREST綜合征）：80%-9

21、5%HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗Scl-70抗Scl-70抗體靶抗原：DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（100kDa）功能：DNA復(fù)制和翻譯過程的輔蛋白相關(guān)性：硬皮?。?5%75%HEp-2/靈長(zhǎng)類肝臟：抗PM-Scl抗PM-Scl抗體靶抗原：多個(gè)蛋白分子的復(fù)合物主要的靶抗原100kDa（與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I不同）功能：未知相關(guān)性：硬皮?。?%-5%肌炎：8%重疊綜合征：24%HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗RNA多聚酶RNA多聚酶I、II和III靶抗原：多個(gè)蛋白亞單位組成的核仁酶復(fù)合物功能：多聚酶I:轉(zhuǎn)錄rRNA基因多聚酶II:轉(zhuǎn)錄mRNA基因多聚酶III:轉(zhuǎn)錄tRNA基因相關(guān)性：硬皮病:4%HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗原纖維蛋白抗原纖維蛋白（U3-nRNP）抗體靶抗原：與基礎(chǔ)蛋白（34kDa）連接的U3-nRNA和其它5個(gè)蛋白功能：分離pre-rRNA相關(guān)性：皮肌炎：5%-10%HEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗NORHEp-2細(xì)胞/靈長(zhǎng)類肝臟：抗Ku多肌炎和皮肌炎的抗體譜靶抗原性率（%）ssDNA40-50Jo-125-35TOC o 1-5 h zPM-Scl（重疊綜合征）8