高春芳-感染性疾病分子診斷及臨床應(yīng)用進(jìn)展

1、感染性疾病分子診斷及臨床應(yīng)用Chunfang GAO(高春芳), Prof. & DirectorDepartment of Laboratory MedicineEastern Hepatobiliary Surgery HospitalSecond Military Medical UniversityE-mail: 報告提綱 臨床分子診斷技術(shù)發(fā)展歷史和現(xiàn)狀分子雜交、分子構(gòu)像、PCR、測序 感染性疾病臨床分子診斷概況 基于NGS技術(shù)的HBV基因檢測在慢乙肝臨床管理中的應(yīng)用 數(shù)字PCR在感染性疾病中的研究應(yīng)用分子診斷發(fā)展歷程一第一階段 基于分子雜交的分子診斷技術(shù)上世紀(jì)60年代至80年代分子雜

2、交技術(shù)發(fā)展最為迅猛的20年遺傳病分子診斷DNA印跡技術(shù)Southern blot 1975熒光原位雜交 (FISH)fluorescence in situ hybridization 1977ASO反向斑點(diǎn)雜交 ASO (ASO-RDB) 1980allele-specific oligonucleotide reverse dot blot多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) MLPAMultiplex ligation-dependent probe amplification歷程二-基于分子構(gòu)象的分子診斷技術(shù)(一) 變性梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electroph

3、oresis，DGGE)單鏈構(gòu)象多態(tài)性1970-1980年(single strand conformation polymorphism，SSCP)(二) 變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography，dHPLC)1997年(三) 高分辨率熔解分析 (high-resolution melting analysis，HRMA)2003年 Wittwer 等首次革命性地使用過飽和熒光染料將PCR產(chǎn)物全長進(jìn)行熒光被動標(biāo)記，再通過簡單的產(chǎn)物熔解分析對單個堿基變化進(jìn)行鑒定分子診斷發(fā)展歷程三-PCR 定性 PCR 定量PCR實(shí)時熒

4、光定量PCR (real-time PCR)1.雙鏈摻入法2.Taqman探針3.分子信標(biāo)4.雙雜交探針 數(shù)字PCR分子診斷發(fā)展歷程四-核酸測序 Sanger sequencingABI 在Sanger法的基礎(chǔ)上，推出了首臺商業(yè)化DNA測序儀PRISM 370A，并以熒光信號接收和計算機(jī)信號分析代替了核素標(biāo)記和放射自顯影檢測體系Sanger加減法/酶法DNA序列測定的方法-ddNTP1975197719861995ABI 推出首臺毛細(xì)管電泳測序儀PRISM310更是使測序的通量提高M(jìn)axam/Gilbert化學(xué)修飾降解法Sanger測序是最為經(jīng)典的一代測序技術(shù)仍是目前獲取核酸序列最為常用的方法

5、HGP and Sanger Sequencing3.2 billion basesDr. Fred SangerDouble Nobel laureatee and the developer ofdideoxy sequencing method, first published inDecember 1977Fred Sanger is a quiet giant, whose discoveriesand inventions transformed our research world.”(A.Bradley, WTSI.)分子診斷臨床應(yīng)用腫瘤感染性疾病遺傳病預(yù)測風(fēng)險預(yù)測病程預(yù)測預(yù)后

6、預(yù)測診斷輔助診斷分子/基因分型分子診斷生殖健康藥物基因組慢病管理治療指導(dǎo)個體化用藥療效監(jiān)測、耐藥監(jiān)測隨訪病程動態(tài)監(jiān)測生存、復(fù)發(fā)監(jiān)測感染性疾病分子診斷臨床應(yīng)用項目種類 病毒： 種類繁多 細(xì)菌： 結(jié)核分枝桿菌、幽門螺桿菌、沙門/志賀氏菌等 真菌：念珠菌等 衣原體、支原體、脲原體等 基因型及耐藥基因-涉及技術(shù) PCR (熒光探針法、RNA恒溫擴(kuò)增) 分子雜交+PCR（反向雜交、芯片法） 微流控+PCR 測序法等3/28/2018病原體相關(guān)分子檢測的關(guān)注熱點(diǎn) 病原體核酸定量檢測敏感性、自動化、準(zhǔn)確（絕對）定量 病原體基因變異檢測 基因分型 多耐藥位點(diǎn)檢測 高危預(yù)測 POCT 化 特殊、復(fù)雜樣本的檢測能

7、力基于NGS技術(shù)HBV基因分析在CHB臨床管理中的應(yīng)用1. 用于抗HBV 核苷（酸）類似物耐藥突變位點(diǎn)及基因型定量研究和應(yīng)用2. 原發(fā)性肝癌高危變異位點(diǎn)研究用于臨床肝硬化/肝癌預(yù)測和預(yù)后監(jiān)測3. HBV 變異與臨床乙肝標(biāo)志物及cccDNA的相關(guān)研究用于臨床檢測結(jié)果的正確詮釋HBV DNA結(jié)構(gòu)P區(qū)：2357-0-1621S區(qū)：2848-833X區(qū)：1374-1836C區(qū)：1814-2450P區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖RTRNA ase-H116128401301129rt1GFABCDErt344Catalytic Region in RT Region:G(aa24-36) F(aa37-47) A(aa7

8、5-90) B(aa159-182) C(aa200-210) D(230-241) E(247-257)突變類型 Primary: 是指對核苷酸類似物敏感性減弱直接相關(guān) Compensatory: 補(bǔ)償性變異不直接與耐藥有關(guān)，但能 修復(fù)病毒的復(fù)制能力 Putative: 推測該突變位點(diǎn)與耐藥相關(guān)，但未得到證實(shí) Pretreatment: 發(fā)現(xiàn)于核苷酸類似物治療前Liu, B. M. Antiviral Res.2010耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)類型突變類型突變位點(diǎn)抗病毒藥物ETVI169T,S202C/G/I,M250I/L/VI163V, A186T, T184A/C/F/G/I/L/M/S主要耐

9、藥突變（primary）A181T/VLAM, LDT, ADV,TNFLAM, ETV, LDT, TNFADV,TNFM204I/V/SM236T,A194TL80I/V,V173LL180M補(bǔ)償性突變(compensatory)LAMLAM, ETV,LDTS53N, L82M, I91L,T128I/NN139T, W153Q, V191I, A200V, V207I,L229G/V/WLAM推測耐藥突變(putative)T54N,V84M,S85A,Y126CS213T,V214A,L217R,E218D,F221Y,I233V ADV,P237H,N238D/S/T,Y245HS

10、/C256GLAM,ETVV191I,Q215P/SLAM,ADV治療前突變(pretreatment)T38A,Y124H,D134E,N139K/H,I224V,R242A發(fā)現(xiàn)于治療前Sanger測序 一代測序HBV核酸提取PCR富集目標(biāo)片段目標(biāo)片段純化定量測序PCR測序數(shù)據(jù)分析測序產(chǎn)物純化 一次只能對一個片段進(jìn)行測序 測序時間 1.5-2天 讀長相對較長，600-800bp 背景噪音難克服，難以確認(rèn)低頻突變HBV RT區(qū) NGS 測序過程HBV核酸提取PCR富集目標(biāo)片段目標(biāo)片段純化定量PCR文庫構(gòu)建Q-PCR文庫質(zhì)檢測序數(shù)據(jù)分析高通量測序堿基質(zhì)量評估方法：Q20=-10log(0.01)

11、，每個堿基出錯的概率為0.01去除Reads數(shù)不足500的樣本數(shù)據(jù)分析過程形成pipeline，進(jìn)行流程化分析測序深度與模型預(yù)測效能關(guān)系樣本reads2000-2500 時，分類模型AUC不再上升不同耐藥突變檢測方法比較HBVDNA定量樣本反向斑點(diǎn)雜交一代測序基因型C二代測序位點(diǎn)基因型位點(diǎn)位點(diǎn)和頻率(%)基因型(%)#151#1573.313.78WTWTCWTWTB/C (25.4/74.6)B/C (45.1/54.9)CCWTCCWT180M204V180M204V180M(98.5)204V(99.28)#130#1564.61C (99.9)C (99.0)180M204V202S/

12、GL180M204V180M(90.1)5.056.40B/CCC204V/I(97.02/1.53)202G(92.9)S202G181T250L#9WTCCWTC (99.3)C (99.5)#846.836.91204VCC181T181T (30.73)#70#87204I204 IWTCC180M (17.4) 204I(99.0)WTC (99.1)C (98.3)第三部7.41204M/V C二代測序與一代測序結(jié)果符合率高，并可檢出低頻突變位點(diǎn)SDCV(%)CV(%)批間組別樣本均數(shù)批內(nèi)12345678998.95 0.25599.07 0.17298.40 0.1520.258

13、高突變組M204(20%)0.1740.1550.56517.4518.5317.601.530.722.211.680.140.150.194.13911.9529.562中突變組M180(5-20%)3.5079.436低突變組I2041.0314.61113.36319.777(5%)1.40同一樣品分成三份，連續(xù)檢測三天二代測序檢測批內(nèi)及批間CV20%，精密度較好質(zhì)控體系QC1QC2L180MM204I(%)混合樣品編號 混合百分比(%) 混合百分比(%)(%)QC110080604020002040608010023.231.640.048.456.867.425.336.547.7

14、58.870.086.1level1level2level3level4QC2L180M(%)M204I(%)預(yù)期突變率(%)測序結(jié)果平均突變率(%)預(yù)期突變率(%)測序結(jié)果平均突變率(%)樣品編號QC123.231.640.048.456.867.426.030.841.348.156.165.925.336.547.758.870.086.122.732.348.158.667.382.1level1level2level3level4QC2報告樣單 5個藥物、11個位點(diǎn) 基因型及耐藥突變均定量報告 有利于發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢、劣勢耐藥株 臨床提供病程預(yù)測/用藥指導(dǎo) 提供相關(guān)片段全基因量化信息（多分子

15、合作平臺）ADV： 阿德福韋酯ETV： 恩替卡韋LVD： 拉米夫定LdT： 替比夫定TDF: 替諾福韋酯3/28/2018高通量測序檢測的優(yōu)勢檢出臨床10071.18%72.86%合計54.77%HCV RNA 陽性指大于1000 IU/ml數(shù)字PCR在感染性疾病中的應(yīng)用 細(xì)菌： 例如結(jié)核菌、耐藥基因、MRSA 病毒： 例如HBV、HCV、 HIV、HPV PUBMed 有超過200 篇的應(yīng)用研究（臨床、環(huán)境衛(wèi)生、復(fù)雜性狀樣本等）PMID2937860029378428KeywordHIVTitleDigital PCR as a tool to measure HIV persistence

16、.JournalRetrovirologyHuman gene therapy methodsYear2018 Jan 302018 Jan 29Virus Determination of Lentiviral Infectious Titer by a Novel Digital Droplet PCR Method.Biology of blood and marrow transplantation :journal of the American Society for29305193Virus Ultra-Sensitive Droplet Digital PCR for the

17、Assessment of Microchimerism in Cellular Therapies.An ultrasensitive electrochemical biosensor for the detection of mecA gene in methicillin-resistantMRSA Staphylococcus aureus.2018 Jan 2288102332908444129085077Biosensors & bioelectronicsAIDS research and human retrovirusesNature microbiology2018 Ja

18、n 152018 Jan2018 JanHIVThe Spleen Is an HIV-1 Sanctuary During Combined Antiretroviral Therapy.Virus Quantification of diverse virus populations in the environment using the polony method.Journal of veterinary diagnostic investigation :official publication of theDetection of Mycobacterium tuberculos

19、is-derived DNA in circulating cell-free DNA from a patient International journal of infectious diseases : IJID :2914829729154831Virus Detection of pseudorabies virus by duplex droplet digital PCR assay.2018 Jan2018 JanMTBwith disseminated infection using digital PCR.official publication of theTransc

20、riptome profiling of two maize inbreds with distinct responses to Gibberella ear rot disease29426290 Infection to identify candidate resistance genes.Phylogenetic analysis of porcine circovirus type 3 and porcine circovirus type 2 in China detectedVirus by duplex nanoparticle-assisted PCR.BMC genomi

21、csInfection, genetics and evolution : journal ofmolecular epidemiology and2018 Feb 92018 Feb 72018 Feb 12018 Feb2018 Feb29427762291421362911817629209860Size, Composition, and Evolution of HIV DNA Populations during Early Antiretroviral Therapy andIntensification with Maraviroc.Highly Sensitive Detection of Isoniazid Heteroresistance in Mycobacterium tuberculosis byDeepMelt