單抗制備的詳細(xì)步驟

1、單克隆抗體研制最詳細(xì)步驟單克隆抗體的研制一、單克隆抗體的概念抗體是機(jī)體右:抗原刺激下產(chǎn)牛的能與該抗原特異件結(jié)合的兔痔球皆白。常規(guī)的抗體制備是通過動(dòng)物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的，因而抗血清通常含有針對其他無關(guān)抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。般的抗原分子大筆含有名個(gè)不同的抗原決宋簇.所以常厠抗體也是針對名個(gè)不同抗険決宋簇抗體的混合物c即使是針對同抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而，黨規(guī)血清抗體又稱多頁隆抗體(polyclonalantibody),簡稱名杭。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大，使它在免疫化學(xué)試驗(yàn)等使用中帶來許多麻煩

2、。因此，制備針對預(yù)定抗原的特界性均質(zhì)的且能保證無限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長期夢寐以求的目標(biāo)。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstem建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征，既像骨髓瘤細(xì)胞樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體(monoclonalantibody),簡

3、稱單抗。與多抗相比，單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的發(fā)展。Kohler和Milstein兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。二、雜交瘤技術(shù)(-)雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機(jī)制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了必要理論基礎(chǔ)，同時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合與雜交細(xì)胞的篩選等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7H,

4、Kohler和Milstein在英國自然雜志上發(fā)農(nóng)了題為“分泌具有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”(Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity)白勺著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃卩票吟鳥卩票吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthineguanosinephosphoribosyltnmsfbnise,HGPRT)的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。融合由仙臺(tái)病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過在含有次黃卩票吟(hypoxanthine,H)、氨基喋吟(a

5、minopterin,A)和胸腺卩密喘核井(thymidine,T)的培養(yǎng)基(HAT)中生長進(jìn)行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和相互融合的脾細(xì)胞是HGPRT+,但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾人，而未融合的HGPRT骨髓瘤細(xì)胞和相互融合的HGPRT骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來自親本脾細(xì)胞的HGPRT和親本骨髓瘤細(xì)胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果完全像起始設(shè)計(jì)的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。用這些細(xì)胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和

6、腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改進(jìn)。最早仙臺(tái)病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨后建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Agl4,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系,只分泌一種針對預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了人鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基本原理和方法是一樣的。（二）基本程序和方法雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實(shí)驗(yàn)室使用的程序不盡一致。本節(jié)

7、中介紹的方法是作者所在實(shí)驗(yàn)室采用的、實(shí)踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（70C）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）.37C水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括:lOOmh50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、lml注射器等，96孑L、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋

8、玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科銀，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（50i】l,200i】l,lOOOul）,彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測的儀器設(shè)備，依據(jù)檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟旬括：動(dòng)物兔疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗楡測、雜交瘤細(xì)胞的克降化、凍存、單抗的鑒宋等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。1、動(dòng)物免疫抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)

9、室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對抗原進(jìn)行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。免疫動(dòng)物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和人鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)椋械墓╇s交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。但是，有時(shí)為了特

10、殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因?yàn)槿旧w容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以812周齡為宜，雌性鼠較便于操作。免疫程序的確定佈疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之，其目的乳于伸B淋巴細(xì)胞卜特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胸融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異件抗體的雜交瘤的機(jī)矣囲此心設(shè)計(jì)能疫稈序時(shí),應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一個(gè)免疫程序能適用于各種抗原。現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表61列舉了目前常用的免疫程序。饑疫途徑常用體內(nèi)兔疫法旬括皮下注対、腸

11、膵或靜脈注射.也采用杲墊、店內(nèi)、滴罠或占眼晶后次加強(qiáng)詭痔名采用腹腔或錘注d目前尤其推崇后者，因?yàn)榭墒箍乖瓕γ劶?xì)胞作用更迅速而充分。在最后次加強(qiáng)兔疫后第3人取脾融合為好，許多實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果衣明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22無,右:初次兔痔應(yīng)答吋茯得的雜交瘤主要分泌噸M拉體.再次詭痔應(yīng)答時(shí)獲得的雜交瘤主棗分泌JgG抗體筆者體會(huì)陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強(qiáng)免疫后第3天取脾進(jìn)行融合較適宜。已有人報(bào)道采用脾內(nèi)免

12、疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應(yīng)性，且節(jié)省時(shí)間，一般免疫3天后即可融合。農(nóng)6不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性抗原量接種次數(shù)間隔時(shí)間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強(qiáng)（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）106-107個(gè)細(xì)胞或1-10ug2-42-4周高中等至強(qiáng)免疫原性中等10-100ug2-424周中等或高中等或強(qiáng)免疫原性弱A.20-400ug2-4隨后2-3每月23月中等強(qiáng)10-50ug其后200-400ug2其后4每月中等2每天中等10-100ug其后4其后“休息”最后加強(qiáng)每月10天仁2月中等中等或強(qiáng)（摘自劉秀梵）體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C(jī)體有害（如引起免疫抑制）的

13、抗原就不適用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不人可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些情況，可采用體外免疫。所謂體外詭疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胸，或外周血淋巴細(xì)胸）取出體外，在宋條件卞與杭原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞講行融合。其基本方法是取48周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液,用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原0.55ug/ml,細(xì)胞抗原105-106個(gè)細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在37C,6%CO2濃度下培養(yǎng)35天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。2、細(xì)胞融合（1）主要試劑的配制a、細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技

14、術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（0.22um）,分裝，4C保存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100XL.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO33.7g雙抗溶液10ml100XL.G.溶液10ml用1NHCI調(diào)試PH至7.2-7.4,過濾除菌，分裝4C保存。完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基

15、：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99mlHT貯存液1mlHAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98mlHT貯存液1mlA貯存液1mlb、氨基喋吟（A）貯存液（100X,4X10-5mol/L）:稱取1.76mg氨基喋吟（AminopterinMW440.4）,溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再補(bǔ)加超純水或四蒸水至100mlo過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），20C保存。c、次黃卩票吟和胸腺I密唳核ffCH

16、T）貯存液（100X,H:10-2mol/L,T：1.6X10-3mol/L）:稱取136.1mg次黃卩票吟（Hypoxanthine.MW136.1）和38.8mg胸腺唏庭核昔（Thymidine.MW242.2）,加超純水或四蒸水至100ml,置45-50C水浴中使完全溶解,過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），20C凍存。用前可置37C加溫助溶。dL谷氨酰胺（L.G.）溶液（100X,0.2mol/L）:稱取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine,MW146.15）,用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），20C凍存。e、青、鏈霉素（雙

17、抗）溶液（100X）:取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g,溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（45ml/瓶），20C凍存。f、7.5%NaHC03溶液：稱取分析純NaHCO37.5g,溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4C保存。g、HEPES溶液（1mol/L）:稱取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonicacid,N-2-g乙基哌嗪N,2乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4C保存。h

18、、8氮鳥卩票吟貯存液（100X）:稱取200mg8氮鳥卩票吟（&azaguanine,MW152.1）,加入4mol/LNaOH1ml,待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml,過濾除菌；分裝小瓶,-20C凍存。使用時(shí)按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）oi、50%PEG:稱取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80C水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，20C存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5%NaHCO3調(diào)PH至8.0,或購買Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前骨髓瘤細(xì)胸維持的方

19、式，對成功地得到雜交瘤是最為乘要的。目標(biāo)是伸細(xì)胞處于對數(shù)牛長的吋間盡可能長，融合前肯宋不能少于1Mo凍存的細(xì)胞右:篦蘇后要2周吋間才能女卜干話合干融合的狀態(tài)，長過了的骨髓瘤細(xì)旳至少幾人才可能恢復(fù)。在寶驗(yàn)宰中外干對數(shù)牛長的晉髓瘤細(xì)胸纟住持右:含10%小牛血漬的培養(yǎng)基中.力汰是用6個(gè)裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相當(dāng)密而又未長過的-瓶重新移植。典型的倍增時(shí)間為14-16小時(shí)。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備方法如K:a、于融合前4836小時(shí)，將骨髓細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗(yàn)約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備）。b、融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶

20、壁瘤輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。c、1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d、加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。e、取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入0.9ml臺(tái)盼藍(lán)染液中，混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)二4個(gè)大方格細(xì)胞數(shù)X105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個(gè)中方格細(xì)胞數(shù)X106/2脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時(shí)的陽性對照血清。同吋通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解

21、剖臺(tái)板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪銀，在超凈臺(tái)中用無菌手術(shù)剪剪開腹般，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平血中，用彎頭銀子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟(也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟)，使脾細(xì)胞進(jìn)入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用200目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心510分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌仁2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺(tái)酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。通常每只小鼠可得1

22、X108-2.5X108個(gè)脾細(xì)胞,每只大鼠脾臟可得5X108-10X108脾細(xì)胞。(4)飼養(yǎng)細(xì)胞(Feedercells)的制備禰細(xì)胞融合后選擇件培養(yǎng)過稈中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相鰥列亡，此吋單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞名半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞伸之繁殖，這種被加入的活細(xì)胸稱先飼養(yǎng)細(xì)胸c飼養(yǎng)細(xì)胸佃講其他細(xì)的增殖的機(jī)制尚不明了,-般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腫口喙細(xì)胞。苴中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細(xì)胞及其碎片的作

23、用，因此使用最為普遍。其制備方法如卜按上述采小鼠脾細(xì)胞的方法將小鼠致死、體農(nóng)消毒和固定后，用消毒剪鍛從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹月莫。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5邛0分鐘，棄上清。先用5mlHAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2X105/ml,備用。通常對巨噬細(xì)胞來說，96孔培養(yǎng)板每孔需2X104個(gè)細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞。每只小鼠可得3-5X106個(gè)細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔

24、板的飼養(yǎng)細(xì)胞。也可在細(xì)胞融合前12天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細(xì)胞層。做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當(dāng)于2滴），然后置37C6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的程序已報(bào)道的有很多種，這里介紹的是作者所在實(shí)驗(yàn)室常用的一種。A、將1X108脾細(xì)胞與2X107-5X107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30ml,充分混勻。B、1000r/min離心510分鐘，將上清盡量吸凈。C、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置40C水浴中預(yù)熱。D、用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時(shí)間

25、為45秒）加預(yù)熱至40C的50%PEG（PH8.0）1ml,邊加邊輕輕攪拌。E、用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37C的不完全培養(yǎng)基；20-37C靜置10分鐘。F、1000r/min5分鐘；棄去上清。G、加入5mlHAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80-100mLH、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.10-0.15ml；分裝24孔板，每孔1.0/.5ml；然后將培養(yǎng)板置37C,6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。I、5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。J、7邛0天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。L、經(jīng)常觀察雜

26、交瘤細(xì)胞牛長惜況，待其長至孔底面積4/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測3、雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞乳融合后2周左右即可篩選,即把分泌所需抗體的朵交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測?？贵w檢測的方法很多，通常根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點(diǎn)。因?yàn)橥袔装賯€(gè)樣品需要在短短幾個(gè)小時(shí)就報(bào)告結(jié)果，以便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，并克服可能存在的問題。另一個(gè)重要問題是抗體檢測方法所需要的“動(dòng)力學(xué)范圍”，即檢

27、出背景以上的最強(qiáng)與最弱信號(hào)之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參與反應(yīng)，一個(gè)陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另方面，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞農(nóng)面微量的蛋白抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號(hào)，則動(dòng)力學(xué)范圍至少應(yīng)為10：1,最好為100：1o另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補(bǔ)體的抗體可以用基于細(xì)胞毒性反應(yīng)的檢測方法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測方法。下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法：(1)兔捋酶村術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶對底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的免疫學(xué)技

28、術(shù)。由于它特異性強(qiáng)，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A、器材和試劑包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/LNa2CO38ml,0.2mol/LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸餡水，調(diào)PH至9.6。Tris-HCI緩沖液(PH8.0,0.02mol/L)：取0,1mol/LTris100ml,0.1mol/LHCI58.4ml混合,加蒸餡水至lOOOmlo洗滌緩沖液(PH7.2的PBS)：KH2PO40.2g,KCI0.2g,Na2HPO4*12H2O2.9g,NaCI8.0g,Tween-200.5ml,加蒸餡水至1000ml。稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g,

29、加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。酶反應(yīng)終止液(2mol/LH2SO4)：取蒸館水178.3ml,滴加濃硫酸(98%)21.7ml。底物緩沖液(PH5.0,磷酸鹽檸檬酸緩沖液):取0.2mol/LNa2HPO425.7ml,0.1ml/L朽檬酸24.3ml,再加50ml蒸餡水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定,易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。底物使用液：OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD5mg,底物緩沖液10ml,3%H2O20.15mLTMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml,底物緩沖液10m

30、l,1%H2O225uLABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS0.5mg,底物緩沖液1ml,3%H2O22uL抗體對照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其他類似試劑。細(xì)胞固定液:20C丙酮；或丙酮甲醛固定液：Na2HPO4100mg,KH2PO4500mg,蒸餡水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml；或丙酮甲醛溶液或20C甲醇。聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。吸管、加樣器及水浴箱、

31、離心機(jī)等。B、可溶件抗原的醸聯(lián)佈悠吸附試輪（ELISA）純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/mlo以50-1OOul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4C過夜或37C吸附2小時(shí)。棄去孔內(nèi)的液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次35分鐘，拍干。每孔加200ul封閉液4C過夜或37C封閉2小時(shí)；該步驟對于一些抗原，可省略。洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可20C或4C保存?zhèn)溆?。每孔?0-1OOul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照;37C孵育小時(shí);洗滌,拍干。加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul,37C孵育仁2小時(shí)，洗滌，拍干。加底物液,每孔加新鮮配制的底物使用液50-100UI,37C10-30分

32、鐘。以2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。結(jié)果判定：以P/NM2.1,或PMN+3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。C、全菌抗原的ELISAS新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餡水或PBS懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至1X108個(gè)/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。每孔中加lOOul5%戊二醛溶液（0.1mol/LNaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml）,37C作用2小時(shí)，蒸餡水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液5OU1/7L;3756C烘干；每孔加200ul封閉液4C過夜或37C2小時(shí)封閉。步驟b也可采用先每孔加

33、50i】l細(xì)菌懸液，37C56C烘干，然后用20C預(yù)冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸懈水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4C過夜或37C2小時(shí)封閉。洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可在20C或4C保存?zhèn)溆谩Ｒ韵虏襟E同上法。D、用全細(xì)胸抗原的ELISA按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS制成適當(dāng)濃度懸液。淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上,15001-pm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加0.83%的氯化鞍溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適當(dāng)濃度。

34、每孔加lOOul上述a或b的細(xì)胞懸液,使每孔含細(xì)胞5X104個(gè)；1500r/min15分鐘,甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮甲醇(1：1)4C固定10分鐘；可4C或20C保存?zhèn)溆谩Ｒ韵虏襟E同上法。E、抗體捕捋ELISA試驗(yàn)本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗體捕捉待檢樣品中的McAb,再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是常用的ELISA中較理想的一種；其操作步驟如下：以適當(dāng)濃度的純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板，每孔加lOOul,37C2小時(shí)或4C過夜。洗滌、拍干后加待測的McAb樣品,37C12小時(shí)。洗滌后加適量的抗原，37C12小時(shí)。洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，3TC12小時(shí)。洗滌后加

35、底物顯色，判定結(jié)果。F、ABC-ELISA試驗(yàn)ABC-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素(Biotin)與親和素(Avidin)間的放大作用。親和素有4個(gè)亞單位組成，對生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如門已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA試驗(yàn)。加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔lOOul,37C1小時(shí)；洗滌。C.加酶標(biāo)親和素，每孔lOOul,37C30分鐘洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。G、DotELISA試驗(yàn).免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(DotELISA)是以硝酸纖維素月莫或醋酸

36、纖維素膜為固相載體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物(如DAB,或4氯蔡酚或AgNO3等)，其與相應(yīng)標(biāo)記物(HRP、AP、膠體金)作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色,從而易于判定結(jié)果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)和免疫金銀斑點(diǎn)法等。其操作步驟大致如下：將抗原液25i】l點(diǎn)加于纖維素般上，室溫37C干燥。將纖維月莫浸入封閉液中，37C30分鐘。用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb樣品，37C1小時(shí)；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig抗體，37C作用30分鐘。同法洗滌，吸干，用新配的相應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗

37、終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。H、免疫組化染色法該法主要用于檢測針對細(xì)胞抗原成分的MeAb,常用的方法是間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IIP,indirectiimnunoperoxidase)及APAAP技術(shù)。其結(jié)果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。兔疫熒光枝術(shù)_免疫沁拉回用土多種抗原的雜交瘤抗體檢測，如細(xì)胞性抗原(包括細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞)、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。A、器材和試劑供檢測抗體用的抗原制備一固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。PBS(PH7.2,0.01mol/L)待檢的McAb樣品。冷丙酮FITC（異硫氧酸熒光素）或

38、TRITC（四甲基異硫氧酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig抗體等熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機(jī)，水浴箱等。B、間接佻疫熒光法一固定細(xì)胞片的制備：生長在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接收獲蓋片,在PBS中洗滌，用4C丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于2（rc保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1X108個(gè)/ml）涂抹7X21mm蓋片上，自然干燥后，用20C丙酮固定1015分鐘，于20C保存?zhèn)溆?。蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10-20U1雜交瘤上清或其他待檢樣品；設(shè)立陽性、陰性對照；置37C水浴孵育0.51小時(shí)。取出蓋片置PBS中

39、用磁力攪拌器洗滌15分鐘。蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul,37C孵育0.51小時(shí)。同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PES）封于干凈載玻片上。光顯微鏡上觀察，陽性結(jié)果可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上，在觀察結(jié)果時(shí)，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。C、細(xì)胞的月莫熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4C操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞腫。必須注意死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過程中要保證細(xì)胞的高活力。

40、活細(xì)胞的膜熒光染色人致步驟如下：制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個(gè)/ml。在小試管（5X50mm）中加入100i】l細(xì)胞懸液，再加入100i】l待檢McAb的樣品,混勻，4C作用30-90分鐘。用洗滌液（PBS900ml,小牛血清50ml,4%NaN350ml）洗二次，每次加洗滌液l-5ml,lOOOr/min離心5分鐘，棄上清。加入lOOul熒光抗體,4C作用30-90分鐘。同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30U1含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中;滴加于載玻片上，加蓋片封載。立即在熒光顯微鏡上檢查。細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4C可保

41、存一周。問撈rfn凝試輪_間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PHA）,是目前應(yīng)用較廣的檢測方法之一。本試驗(yàn)是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象。可見，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點(diǎn)，而且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來重復(fù)性差的缺點(diǎn)。A、器材和試劑綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。緩沖液：PBS（PH7.2）；醋酸緩沖液。甲醛，丙酮醛，NaN3,抗凝劑等。血凝板，振蕩器等。E、多糖抗原的間接血凝試驗(yàn)甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml,用枸椽酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積的PH7.2PBS（N

42、a2HPO412H2O3.58g,KH2PO40.41g,NaCl8.01g,蒸餡水1000ml）充分洗滌5次，每次1500r/min5-10分鐘，直至上清測定無蛋白質(zhì)（用飽和硫酸鞍滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，37C水浴作用2小時(shí)，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH7.2PBS洗滌4次，每次2000r/min10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4C保存?zhèn)溆谩Ｖ嗵强乖旅艏兹┗d羊

43、紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS）,以0.2mol/LPH8.0PB液，調(diào)整多糖濃度至120ug/ml,然后100C水浴處理1小時(shí)；將冷卻至37C的熱處理LPS與6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37C攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min10分鐘，以0.01mol/LPH7.2PES洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4C備用，或凍干保存。McAb的篩選：取待測McAb樣,Si25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時(shí)設(shè)立陰性、陽性對照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25M,在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37C30-60分鐘觀察結(jié)果。陰性對照孔應(yīng)呈緊縮的圓點(diǎn)。C、可溶性蛋白抗原的間接血凝試驗(yàn)紅

44、細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗滌46次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS,于室溫緩慢攪拌17小時(shí)；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0.1%NaN3防腐，4C保存?zhèn)溆谩Ｖ旅艏t細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0.1ml,1500r/minl0分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加0.2mol/LPH4.0醋酸醋酸鈉緩沖液lml,并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原lml,混勻，于45C致敏30分鐘，有時(shí)輕輕搖動(dòng)，使紅細(xì)胞不卜-沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的PB

45、S洗34次，最后用PBS配成0.5-1%致敏紅細(xì)胞，4C保存?zhèn)溆?。McAb測定：同上法。（4）放射兔痔測宋一放射免疫測定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測相應(yīng)抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時(shí)常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的MeAb,其操作步驟如門用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（l100i】g/ml）,滴加聚乙烯微板孔內(nèi)，lOOul/孔,4C過夜或37C2小時(shí)。棄去抗原液,每孔加lOOul含0.5-1%BSA的PBS,4C12小時(shí)封閉。用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。加待檢樣品，每孔lOOul,設(shè)立陰性孔、陽性孔和空白孔；37Cl-2小時(shí)，同法洗滌

46、。每孔加1251標(biāo)記的抗鼠Ig抗體工作液lOOul,37C12小時(shí)，同法洗滌。f用Y射線閃爍計(jì)數(shù)儀分別測定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分別超過本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比犬于3的樣品定為陽性。4雜交瘤細(xì)胸的點(diǎn)隆化從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個(gè)或多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞

47、克隆），也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測抗體分泌情況。通常在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行23次克隆化，有時(shí)述需進(jìn)行多次。所謂審降化是指伸單個(gè)細(xì)胞無件繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個(gè)培養(yǎng)過稈。審隆化的方法很名如有限稀釋法、軟瓊脂汶、單細(xì)胸兄微操作法、單審隆細(xì)胸隼團(tuán)兄微操作法和滎來激話細(xì)胸分類仗（FACS）分離汰這里介紹最簡單也是使用最廣泛的前兩種方法。（1）有限稀釋法材料：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；HT培養(yǎng)基；活力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞；小鼠腹腔細(xì)胞。方法：制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用

48、含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個(gè)細(xì)胞3中不同的稀釋度。按每毫升加入5X104-1X105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孑I.板一塊每個(gè)稀M3271.每孔量為0.2ml,每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10o37C、7.5%CO2濕潤培養(yǎng)710天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存。本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計(jì)數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進(jìn)行系列稀釋,直至每毫升含10個(gè)細(xì)胞，按每孔接種0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含

49、1個(gè)細(xì)胞。（2）軟瓊脂法材料：HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。用0.15mol/LNaCl配制的2.0%瓊脂糖:稱取2.0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖,懸浮于100ml0.15mol/LNaCl,121C高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4C保存。小鼠腹腔細(xì)胞。滅菌平皿。45C水浴?；盍芎玫碾s交瘤細(xì)胞。方法：在培養(yǎng)IIII中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45C水浴中溫育。吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml,室溫10分鐘。取雜交瘤細(xì)胞懸液lml,加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液lml混勻，鋪于上層。37C、7.5

50、%濕潤培養(yǎng)714天；克隆生長至2mm時(shí)，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴(kuò)大培養(yǎng)。吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。5、朵交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（1）雜交瘤細(xì)胞的凍存在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時(shí)一次融合產(chǎn)生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細(xì)胞作進(jìn)-步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來；另一方面，為了防止實(shí)驗(yàn)室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災(zāi)難，通常盡可能早地凍存一部分細(xì)胞作為種子，以免遭到不測。在雜交瘤細(xì)胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時(shí)取用。細(xì)胞凍存的原理是細(xì)胞右:加血清和

51、二甲基亞硯的培養(yǎng)基中以宋的韁嵋速鹿下降溫席（QC二JOC.每分鐘卞降1_C,20C40C每分鐘卞隆2C）可在二196c液軌或液紅蒸氣中長期保存卜面介紹我們實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞凍存方法，經(jīng)幾年來對多種細(xì)胞的使用，細(xì)胞復(fù)蘇存活率均在80%以上。A、材料:帶蓋吸管筒一只（鋁質(zhì)或洋鐵皮制），內(nèi)壁（包括筒底和蓋）襯12層石棉紙或石棉布。含10-20%血清、510%DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至0C左右（用作凍存液）。滅菌安瓶或帶蓋小瓶。70C冰箱。液氮及液氮罐。處于對數(shù)生長中期、健康而活力好的雜交瘤細(xì)胞。B、方法:將雜交瘤細(xì)胞（或其他細(xì)胞）離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為106107左右/ml,分裝安瓶

52、，每瓶lml,置冰浴上；安瓶上標(biāo)明細(xì)胞名稱、凍存FI期、批號(hào)等。安瓶封口后仍置冰浴上。將安瓶放入-帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上標(biāo)明凍存號(hào)、細(xì)胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內(nèi)，置70C冰箱。24小時(shí)后或過夜后從70C冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細(xì)記錄。液氮罐應(yīng)定期補(bǔ)充液氮（最好是專人管理）；補(bǔ)充液氮及存取細(xì)胞時(shí)應(yīng)帶保護(hù)眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。（2）雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞在液氮中保存，若無意外情況時(shí)，可保存數(shù)年至數(shù)十年。寡蘇吋融無細(xì)胸殊店?？?伸步迅殊誦過晶易考揚(yáng)的5CQC以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引起細(xì)胸外

53、亡通常情況下，凍存時(shí)細(xì)胞數(shù)量多，生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞系以及其他細(xì)胞的復(fù)蘇可采用以下方法，這也是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室普遍采用的程序。即復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出安瓶，立即在37C水浴融化，待最后一點(diǎn)冰塊快要融化時(shí)，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10mlHT培養(yǎng)基稀釋，1000r/min10分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或24孔板，置3TC,7.5%CO2培養(yǎng)。如果細(xì)胞存活力不高，死細(xì)胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。不過，凍存的細(xì)胞并不都能100%復(fù)蘇成功，其原因較多，如凍存時(shí)細(xì)胞數(shù)量少或生長狀態(tài)不良，或復(fù)蘇時(shí)培養(yǎng)條件改變或方法不當(dāng)，也可能細(xì)胞受細(xì)菌或支原體污染，以及液

54、氮罐保管不善等。在出現(xiàn)上述情況時(shí)，可采用一些補(bǔ)救方法復(fù)蘇這些細(xì)胞，如小鼠皮下形成實(shí)體瘤法，脾內(nèi)接種法，小鼠腹腔誘生腹水和實(shí)體瘤法，以及96孔板培養(yǎng)法等。6、單抗特性的鑒定單審隆件的確宋一包括雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗兔疫球錯(cuò)白重缽和輕舗類型的鑒d和單抗純度鑒d等。A、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細(xì)胞的客觀指標(biāo)之-，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40,小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為62-68,NS1為54-64；同時(shí)骨髓瘤細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)上反映兩種親本細(xì)胞的特點(diǎn)，除多數(shù)為端著絲點(diǎn)染色體外，還出現(xiàn)少

55、數(shù)標(biāo)志染色體。另一方面，雜交瘤細(xì)胞的染色體分析對了解雜交瘤分泌單抗的能力有一定的意義，一般來說，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目較多且較集中，其分泌能力則高，反之，其分泌單抗能力則低。椅杳雜交瘤細(xì)胸染色體的方法晶常甲秋水仙素汰.其原理是應(yīng)用秋水仙素特顯的破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細(xì)胞；再用0.075mol/LKC1溶液等低滲處理，使細(xì)胞膨脹，體積增大，染色體松散；經(jīng)甲醇冰醋酸溶液固定，即可觀察檢查。其操作步驟如下：在加秋水仙素前48-36小時(shí)將雜交瘤細(xì)胞傳代。秋水仙素處理：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素（100ug/ml,除菌，20C保存），使最終濃度為0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺則最終濃度為0.02

56、-0.05ug/ml）；繼續(xù)培養(yǎng)46小時(shí)，然后吹打細(xì)胞，移入離心管中，1000r/min10分鐘，棄上清。加入已預(yù)溫到37C的0.075mol/LKCl溶液5ml,將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，37C水浴1520分鐘。向懸液中加入新配制的固定液（甲醇與冰醋酸3:1混合）lml,混勻，然后lOOOr/min10分鐘，棄去上清液；本步驟的目的是使細(xì)胞農(nóng)面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成團(tuán)塊。加入固定液5ml,將細(xì)胞懸浮并混勻，室溫靜置2030分鐘，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；重復(fù)操作一次；其后加5ml固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻，封上管口，置4C過夜。取出離心管，1000r/min5分鐘，輕輕

57、吸去上清液，根據(jù)細(xì)胞壓積多少而留下0.5lml固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻后，吸取細(xì)胞懸液12滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過數(shù)次，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g,甘油33ml,55-60C保溫2小時(shí)，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份，加l/15mol/LPH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析。每份標(biāo)本應(yīng)計(jì)數(shù)100個(gè)完整的中期核細(xì)胞，并注意觀察是否有標(biāo)

58、志染色體?？乖幰咔驆o白的類別和亞類鑒宋_抗體的類和亞類對決定提純的方法有很大的幫助。除采用特殊的免疫方法和檢測方法，最經(jīng)常得到的單抗是IgM和IgG,分泌IgE的雜交瘤細(xì)胞很少見，而分泌IgA的雜交瘤通常只有在用于融合的淋巴細(xì)胞來自腸道相關(guān)淋巴組織才能得到。如在抗體檢測中使用葡萄球菌A蛋白試劑，則不可能得到IgG以外的其他類的抗體。鑒定單抗Ig類和亞類的方法主要有兩種，種是兔疫擴(kuò)散，另-種是ELISA。（A）免疫擴(kuò)散法這種方法簡便、準(zhǔn)確，最常用。被檢的McAb樣品通常為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，由于其中單抗的濃度較低，應(yīng)先將其濃縮1020倍左右再檢測。小鼠腹水中的單抗?jié)舛入m很高，但也含有小鼠本身的

59、各類Ig,它們也會(huì)與相應(yīng)抗血清發(fā)生反應(yīng)，使鑒定結(jié)果出現(xiàn)混亂，即使將腹水稀釋1020倍后再檢測也不能完全避免上述情況的發(fā)生，因此一般不用腹水型單抗作為被檢樣品。材料：小鼠IgG及其亞類IgGkIgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。0.06mol/L巴比妥鈉鹽酸緩沖液（PH8.6）。1%瓊脂糖凝膠：lg瓊脂糖加入100ml0.06ml/LPH&6巴比妥鈉鹽酸緩沖液中，隔水煮沸溶解，加0.02%NaN3防腐，4C保存?zhèn)溆谩崈糨d玻片，打孔器（直徑3mm）,濕盒，酒精燈。方法：雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的濃縮：取該上清液10ml裝入透析袋中，用線扎緊，放在小燒杯中，透析袋周圍堆置PEG6

60、000或蔗糖或PVP（聚乙烯毗咯烷酮polyvinylpyrrolidone）,放于4C數(shù)小時(shí)，待透析袋內(nèi)液體量濃縮至約0.5-lml時(shí)，吸出，可于20C保存?zhèn)溆?；也可采用吹風(fēng)蒸發(fā)濃縮。加熱溶化1%瓊脂糖凝膠，鋪制瓊脂糖板，每片約3ml。待瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周圍6孔）,然后封底。向中央孔加入抗小鼠IgG類或亞類抗血清，周圍孔加入待檢樣品；加樣后將瓊脂板放入濕盒，置37C水浴箱中1224小時(shí)或4C過夜，觀察結(jié)果。（B）ELISA法該法不需要將樣品濃縮，而且比免疫擴(kuò)散法更快地得到結(jié)果。材料：ELISA所需用溶液同雜交瘤細(xì)胞的篩選一節(jié)。酶標(biāo)板。山羊抗鼠Ig;兔