細胞生物學技術一

1、關于細胞生物學技術一第一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月2第一節(jié)培養(yǎng)細胞的細胞生物學第二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月3主要內容（一）體內、外細胞的差異（二）體外培養(yǎng)細胞的分型 （三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 第三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月4體外培養(yǎng)的細胞和體內細胞的比較相似：仍存在細胞和細胞、 細胞和基質的相互關系單個細胞雖能生長繁殖, 但不如群體細胞能力強， 當相鄰細胞接觸，便導致運動停止 細胞相互溝通生物信息的結果對細胞外基質仍有依存性 差異：失去原有組織結構和細胞形態(tài)， 分化減弱或不明顯 第四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月5細胞

2、外基質存在于組織中，由細胞合成并分泌至胞外的成分，分布在細胞表面或細胞之間的大分子，包括纖維性成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子(主要為糖胺聚糖)等，其對細胞增殖和分化發(fā)揮重要調控作用。這些物質構成復雜的網(wǎng)架結構，支持并連接組織結構、調節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。 第五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月61影響細胞的存活、生長與死亡 正常真核細胞，大多須粘附于特定的細胞外基質上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性（anchorage dependence）。例如，上皮細胞及內皮細胞一旦脫離了細胞外基質則會發(fā)生程序性死亡。第六張，P

3、PT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月72決定細胞的形狀 細胞呈單個游離狀態(tài)時多呈球形。同一種細胞在不同的細胞外基質上粘附時可表現(xiàn)出完全不同的形狀。細胞外基質決定細胞的形狀這一作用是通過其受體影響細胞骨架的組裝而實現(xiàn)的。第七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月83控制細胞的分化 細胞通過與特定的細胞外基質成分作用而發(fā)生分化。例如，成肌細胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖，進行分化，融合為肌管。第八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月94參與細胞的遷移 細胞外基質可以控制細胞遷移的速度與方向，并為細胞遷移提供“腳手架”。細胞的遷移依賴于細胞的粘附與

4、細胞骨架的組裝。細胞粘附于一定的細胞外基質時誘導粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系細胞外基質與細胞骨架“鉚釘”。 第九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月10（一）體內、外細胞的差異體內：神經和體液的調節(jié)、細胞間相互影響體外：缺乏動態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境發(fā)生的變化分化現(xiàn)象減弱形態(tài)功能趨于單一化一定時間后死亡或者轉化獲得不死性第十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月11體外培養(yǎng)的細胞仍具有研究的意義許多性狀仍與體內相同如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動，細胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應基因關閉開啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達與調控提供線索。第十一張，PPT共一百零五頁，

5、創(chuàng)作于2022年6月12（二）體外培養(yǎng)細胞的分型 貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按體內組織學標推判定懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，白血病細胞，骨髓細胞或免疫細胞，不需要細胞間和細胞與培養(yǎng)表面的接觸 。第十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月13貼附型細胞的分類成纖維細胞型上皮型細胞游走細胞型多型細胞型第十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月14成纖維細胞型梭型或不規(guī)則三角形，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態(tài)。凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似時皆可稱為成纖維細胞。第

6、十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月15第十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月16上皮型細胞：扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，細胞很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。第十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月17游走細胞型：散在生長，不連成片，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。第十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月18多型細胞型：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。第十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作

7、于2022年6月19（三）培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程第十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月20培養(yǎng)細胞的生命周期是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。 種類、供體的年齡等。人胚成纖維細胞可傳3050代，約150300個增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細胞僅可傳幾代供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。當細胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發(fā)生改變。第二十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月21生命周期的三個階段原代培養(yǎng)期傳代期 衰退期 第二十一張，PPT共一

8、百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月22原代培養(yǎng)：從體內取出組織,分離出細胞、接種培養(yǎng) 到 第一次傳代。原代培養(yǎng)（Primary Culture）期原代培養(yǎng)細胞與體內原組織細胞在形態(tài)結構和功能上相似性大。特點細胞群是異質的（Heterogeneous）細胞克隆形成率（Cloning Efficiency）低，即細胞獨立生存性差。由于原代培養(yǎng)細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象第二十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月23原代培養(yǎng)分為兩種方法直接接種組織塊由組織分離出細胞后接種第二十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月24第二十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于202

9、2年6月25組織塊接種：牛胎兒成纖維細胞第二十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月26傳代期：原代培養(yǎng)細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。為保持二倍體細胞性質，細胞應在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當傳代1050次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。第二十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月27衰退期：增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。少數(shù)情況下，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化（Spontaneous Transformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（

10、Immortality）或惡性性質（Malignancy）。這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。第二十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月28細胞的一代生存期1潛伏期（Latent Phase） 2指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase） 3停滯期（Stagnate Phase） 第二十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月291潛伏期（Latent

11、Phase）細胞接種培養(yǎng)后，先是懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。接著細胞貼附于底物表面，稱貼壁，各種細胞貼附速度不同，這與細胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質等密切相關。經過延展過程變成極性細胞可運動，基本無增殖。細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。第二十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月30不同的細胞貼壁的時間不同如巨噬細胞、成纖維細胞等粘附能力強, 能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內粘附到固相表面 如神經元細胞、羊水細胞，粘附能力弱, 需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面可利用此特點（粘附：快、牢；慢、弱） 分離、純化細胞 第

12、三十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月31第三十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月32貼附過程 ：3步貼附因子粘附細胞開始附著細胞進一步牢固附著伸展第三十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月33細胞貼壁影響因素生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機械、物理等其他因素：流動：培養(yǎng)液流動可阻止細胞附著離心：促進附著低溫：可抑制附著第三十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月34加速細胞貼壁的措施包被培養(yǎng)皿底面：對分化程度高、生長能力差的細胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細胞粘附和生長的生物活性物質 如:-通過其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部, 培養(yǎng)的細胞再與其結合。血

13、清內含有多種能夠促進細胞粘附的成分減少接種時細胞懸液的量，待細胞粘附和貼壁之后，再補充足夠的培養(yǎng)液第三十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月35培養(yǎng)液中離子成分及其濃度如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于 細胞的粘附、貼壁和鋪展合適的培養(yǎng)溫度第三十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月36細胞鋪展（伸展） (spread) 進行生命活動的一種基本的生長特點或生長行為鋪展狀況制約細胞的分裂增殖活動鋪展的過程細胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細胞) 逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細，鋪展的越好與生長基質的表面接觸面越大極性細胞就是細胞在體外的特征性細胞形態(tài)鋪展狀況與細胞的生長有密切關系

14、只有當細胞鋪展到合適的程度DNA合成才開始進行第三十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月372， 指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）是細胞增值最旺盛的階段，是細胞一代中活力最好的時期,是進行各種實驗最好的和最主要的階段。以細胞分裂指數(shù)（Mitotic Index：MI）作為判定細胞生長旺盛與否的重要標志。即每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，原代細胞分裂指數(shù)低，永生細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大

15、影響 第三十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月382， 指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）接觸抑制（Contact Inhibition）由于細胞增殖而的相互接觸，進而抑制細胞的運動和增殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個十分有趣的現(xiàn)象。當周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時,一旦上皮細胞互相接觸,就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫接觸抑制。因此,創(chuàng)面上不會出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和神秘的調控現(xiàn)象。 第三十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作

16、于2022年6月39接觸抑制（Contact inhibition）細胞相互接觸時，將停止增長；細胞停留在細胞周期的G0期；轉化的細胞卻可以繼續(xù)生長導致細胞重疊堆積生長。第三十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月403停滯期（Stagnate Phase）：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進行

17、了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后，才能再用。第四十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月41第二節(jié) 細胞培養(yǎng)第四十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月42主 要 內 容（一）細胞培養(yǎng)所需條件（二）細胞培養(yǎng)所需用品（三）細胞培養(yǎng)液（四）細胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細胞的凍存和復蘇（六）細胞污染第四十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月43（一）細胞培養(yǎng)所需條件 1 營養(yǎng)需要 2 細胞的生存環(huán)境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4

18、 滲透壓 濕度 3 無污染 4 無毒第四十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月44（二）細胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存管第四十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月451超凈工作臺(Hood): A.水平流超凈工作臺(Horizontal air flow) B.垂直流超凈工作臺(Lateral air flow)C.層流空氣超凈工作臺(Laminar air flow)第四十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月4

19、6水平流超凈工作臺背送風，但病毒是不實用的，容易對人有害第四十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月47垂直流超凈工作臺第四十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月48第四十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月49超凈工作臺的清潔維護： 保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實驗結束后應先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。第四十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月50整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正

20、 確 錯 誤第五十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月51接種過程中盡可能達到懸空要求防止操作帶來的污染正 確 錯 誤第五十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月52接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口正 確 錯 誤第五十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月53瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正 確 錯 誤第五十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月542，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37 ，100%濕度，5CO2 。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題 用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。 定期消毒（90 ，14

21、h)。 箱內滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水， 以保持箱內濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第五十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月55濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠第五十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月563消毒設備： A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110 C，15 lb，20 分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9 lb， 10 分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。 B.干熱消毒箱：150-200 C， 2 -3小時。 適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛 等，酒精濃度為7595 。 第五十六張，PPT共一百零五頁，

22、創(chuàng)作于2022年6月57高壓消毒鍋第五十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月58 D. 濾膜過濾：正壓過濾: 蠕動泵通入培液；通入氣體。 負壓過濾：用水泵或油泵抽濾。 濾膜孔徑為0.22m，為延長濾膜壽命可同時添加0.45 m和1.2 m 濾膜。第五十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月59濾 膜 濾 器第五十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月60兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）第六十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月614. 蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)： 1）用三蒸水，通過去離子純水 系統(tǒng)，電阻需達到170萬歐姆以上。 2）專門的去離子

23、水系統(tǒng)5. 倒置相差顯微鏡： 需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應與接物鏡的放大倍數(shù)一致。第六十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月62純水系統(tǒng) 第六十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月63倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉第六十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月645，培養(yǎng)器皿第六十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月65培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶第六十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月665，恒溫水浴箱，血清滅活，細胞解凍第六十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月676，移液管第六十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于20

24、22年6月68第六十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月69第六十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月707，低速離心機第七十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月71（三）細胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys 5A、M199、F12等第七十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月72Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3, 丙酮酸鈉、抗生素等第七十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月73Hyclone胎牛

25、血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進行分裝，避免反復凍融，血清保存要放置20第七十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月74培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標準，有幾點建議可供參考 選擇培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)液。可以查閱參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。 其它實驗室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細胞。 用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。 總之，首選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。第七十四張，P

26、PT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月75血清使用注意事項血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請勿超過一個月。血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物顯著增多，且會影響血清之品質。勿將血清置于37太久，若在

27、37放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質第七十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月76補體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細胞溶解（抗體包裹細胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關系統(tǒng)。補體系統(tǒng)主要的功能是通過 在病原體表面的作用，破壞其細胞膜或者“調理”病原體表面供巨噬細胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應。 加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。 第七十六張，P

28、PT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月77凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因為會阻塞過濾膜。 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，

29、更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。 血清沉淀物 第七十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月78谷氨酰胺L谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 配制方法為 ：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分攪拌溶解后（應加溫30），過濾除菌，分裝

30、小瓶，-20保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM 第七十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月79酚 紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示橙色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 第七十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月80細胞消化液由組織中分離細胞和細胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺四

31、乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨或混合使用第八十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月81胰蛋白酶溶液主要作用：使細胞間的蛋白質水解，使細胞相互離散消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA4Na 溶液一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA 處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細胞生長第八十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月82（四）細胞的原代和傳代培養(yǎng)第八十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月83鼠胎組織細胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅

32、速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入510ml細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶

33、中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第八十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月84全量換液和半量換液 換液時機的選擇：培養(yǎng)液pH值：細胞生長旺盛，代謝產生酸性物質積累增多， pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細胞狀態(tài)細 胞 換 液第八十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月85細 胞 傳 代原代細胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細胞株細胞系傳代以得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續(xù)接觸抑制營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的器皿中進行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細胞世代或倍增不同，在一代中，細胞培增36次第八十五張，

34、PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月86消化法傳代培養(yǎng)步驟第八十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月87(五)細胞凍存和復蘇冷凍保存要點冷凍過程要緩慢：緩凍速溶4 3060 分鐘-20 30 分鐘 -80 1618 小時（或過夜）液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1 凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90，無微生物污染。細胞濃度控制在：5x1062x107/ml。常用細胞冷凍保存液5%或10DMSO完全培養(yǎng)液10甘油完全培養(yǎng)液第八十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月88冷凍細胞注意事項凍存液配制 : 現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積：要小，0.5-1 ml凍

35、存細胞數(shù)：與正常傳代細胞數(shù)目要相當，避免復蘇后細胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度： 降溫緩慢 4C，1030 min -20C，1 - 2 h -80C，1 hour 過夜 -196C，1- 2 year 完善記錄：凍存細胞名稱，PD，凍存日期，凍 存人，存放位置，其它特殊信息等第八十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月89細胞凍存管，做好標記第八十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月90第九十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月91細 胞 復 蘇速融凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化（不要超過3 分鐘）解凍后的細胞可直接

36、接種到含完全培養(yǎng)液中直接進行培養(yǎng)，24 小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細胞對冷凍保護劑特別敏感解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中第九十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月92（六）細 胞 污 染細菌污染真菌污染細菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除第九十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月93細菌污染 細胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增

37、多、增粗，最后變圓脫落死亡。 第九十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月94真菌污染真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。 第九十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月95白色念珠菌（倒置顯微鏡下） 中間長梭型的是正在分裂的念珠菌 第九十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月96細菌和真菌的清除 使用抗生素抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 污染后清除用藥需采用大于常用量510倍藥物沖洗法，于加藥后作用2448小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。第九十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月9795以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發(fā)生率達到11%能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達不能通過可視法對其進行檢測對細胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實驗器具不潔等已受污染的細胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染第九十七張，PPT共一百零五頁，