細(xì)菌內(nèi)毒素檢查6.《中國藥典》 2015年版BET法

1、中國藥典 2015年版BET法湛江安度斯生物有限公司2017年5月1中國藥典 2015年版BET法綜述實(shí)驗(yàn)BET2四部 通則 11431.綜述部分細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的定義及方法學(xué)分類細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和檢查用水BET操作和器具的要求供試品溶液的制備內(nèi)毒素限值的確定最大有效稀釋倍數(shù)和最小有效稀釋濃度的計(jì)算32.實(shí)驗(yàn)部分凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法凝膠限度試驗(yàn)?zāi)z半定量試驗(yàn)光度測(cè)定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)檢查法43.2015年版與2010年版ChPBET法主要不同點(diǎn)項(xiàng)目2010年2015年仲裁方法以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)以凝膠限度試驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)操作要求應(yīng)防止微生物和內(nèi)毒素的污染”應(yīng)防止內(nèi)毒素的

2、污染”；刪除“微生物”。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品用途用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)用途增加：干擾試驗(yàn)及檢查法中編號(hào) B 和 C 溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測(cè)定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可 靠性試驗(yàn)。5明確仲裁方法避免誤解項(xiàng)目2010年2015年細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用途用于試驗(yàn)中的鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對(duì)照 用于干擾試驗(yàn)及檢查法中編號(hào)B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)、光度測(cè)定法中標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)供試品溶液pH值的要求供試品溶液的pH 值在6.08.0的范圍內(nèi)供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的 pH 值在 6.08.0的范圍內(nèi)c計(jì)算公式

3、cantilg （X / 4 )c=antilg（X/n）；n 為每個(gè)濃度的平行管數(shù)干擾試驗(yàn)方法：溶液C各平行4管方法：溶液C各平行2管判斷：0.5Es2； 0.5EsEt2Es判斷：溶液C和溶液B的結(jié)果，符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的要求。67項(xiàng)目2010年2015年凝膠半定量結(jié)果判斷系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（X/2）。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判定供試品不符合規(guī)定。 系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以，為

4、每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列的內(nèi)毒素濃度C。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（C/2）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值，則判定供試品不符合規(guī)定。項(xiàng)目2010年2015年凝膠限度試驗(yàn)供試品溶液：稀釋倍數(shù)為MVD供試品溶液：稀釋倍數(shù)不超過MVD結(jié)果判斷：/增加：若供試品的稀釋倍數(shù)小于 MVD 而溶液 A 出現(xiàn)不符合規(guī)定時(shí)，需將供試品稀釋至 MVD 重新實(shí)驗(yàn)，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。動(dòng)態(tài)濁度法定義是檢測(cè)反應(yīng)

5、混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。是檢測(cè)反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度或透光率所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。8項(xiàng)目2010年2015年動(dòng)態(tài)顯色法定義動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測(cè)色度增長速度的方法。動(dòng)態(tài)顯色法是檢測(cè)反應(yīng)混合物的吸光度或透光率達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的檢測(cè)值所需要的反應(yīng)時(shí)間，或檢測(cè)值增加速度的方法。光度法結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間陰性對(duì)照的吸光度或透光率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)檢測(cè)值或陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間；9供試

6、品溶液pH值的要求2010年版 一般要求供試品溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)。對(duì)于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。2015年版必要時(shí)，可調(diào)節(jié)被測(cè)溶液（或其稀釋液）的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.08.0的范圍內(nèi)為宜，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。10供試品溶液PH值的要求鱟試劑本身具有緩沖能力，可以將大部分供試品的pH值調(diào)節(jié)至6.08.0的范圍內(nèi)；對(duì)于供試品pH值的調(diào)節(jié)不是必須的；檢測(cè)供試品溶液和鱟試劑1：1混合后溶液的pH值11凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果判斷方法2010年版只有

7、當(dāng)溶液A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C 的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es 和Et）。 Es=antilg（Xs/4）；Et=antilg（Xt/4） 式中Xs、Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。當(dāng)Es在0.52（包括0.5和2）及Et在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。12凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果判斷方法2015年版只有當(dāng)溶液A 和陰性對(duì)照溶液D 的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)

8、系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的要求時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。13凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果判斷方法試驗(yàn)有效性的判斷一致；判為無干擾的條件不同；2010年版：0.5Es2；0.5EsEt2Es；2015年版：系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)的要求；14平行管數(shù)溶液C（Es）21234平行管數(shù)溶液B（Et）SE2SESESE1234最理想的無干擾狀況，Et=Es。表a15平行管數(shù)溶液C（Es）21234平行管數(shù)溶液B（Et）SE2SESESE1234不符合2010年版要求，但符合2015年版要求表b162010年：Es=;Es=,2Es=;Et=2 ，存在干擾作用！2015年

9、： B=2 ，無干擾作用！但實(shí)際可能存在抑制干擾作用。平行管數(shù)溶液C（Es）21-2-3-4-平行管數(shù)溶液B（Et）SE2SESESE1+2+3+4+不符合2010年版要求，但符合2015年版要求表c172010年：Es=2;Es=,2Es=4;Et= ，存在干擾作用！2015年： B= ，無干擾作用！但實(shí)際可能存在增強(qiáng)干擾作用。平行管數(shù)溶液C（Es）21234平行管數(shù)溶液B（Et）SE2SESESE12342010年版無法判斷，不符合2015年版要求表d182010年：Es=;Es=,2Es=;Et0.42 ，無法判斷！2015年： B0.42 ，存在干擾作用！凝膠法干擾試驗(yàn)結(jié)果判斷方法20

10、10年版的判斷方法存在：干擾無干擾無法判斷2015年版，避免了無法判斷的情況，但是可能存在誤判的情況！需要謹(jǐn)慎對(duì)待判斷結(jié)果，出現(xiàn)表b和表c的結(jié)果應(yīng)調(diào)整試驗(yàn)條件，重新試驗(yàn)。19凝膠半定量試驗(yàn)結(jié)果判斷方法202010年版系列溶液A中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（X/2）。若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值，判定供試品不符合規(guī)定。結(jié)果判斷方法2015年版系列溶液A中每一系列的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品，則將終點(diǎn)濃度乘以供試品進(jìn)行半定量試驗(yàn)的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列的內(nèi)毒素濃度C。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度按公式CE=antilg（C/2）。若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值，則判定供試品不符合規(guī)定。21結(jié)果判斷方法2010年版：將溶液A中的兩個(gè)平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值與限值進(jìn)行比較，幾何平均值大于限