分子生物學(xué)檢驗：單基因遺傳病的分子診斷

1、單基因遺傳病的分子診斷單基因遺傳病致病基因：能夠?qū)е逻z傳病或者與遺傳病發(fā)生相關(guān)的基因遺傳方式：一對等位基因，常染色體遺傳，X連鎖遺傳，Y連鎖遺傳，顯性遺傳，隱性遺傳遺傳性疾病分子診斷的策略一、直接診斷策略二、基因多態(tài)性連鎖分析三、基因突變的定量（dosage）診斷 四、產(chǎn)前診斷定義：直接檢測導(dǎo)致遺傳性疾病的各種基因突變類型： 點突變 缺失 插入 倍增前提：基因已經(jīng)克隆，序列和結(jié)構(gòu)清楚一、直接診斷策略一、直接診斷策略針對不同類型的突變，可以使用不同的方法進(jìn)行檢測，不同的方法可互補。目前，幾乎所有類型的突變都有相應(yīng)的方法檢測到。一、直接診斷策略突變類型方法舉例微小突變錯義/無義突變剪接突變調(diào)控區(qū)序

2、列突變小缺失/插入基因測序，AS-PCR，PCR-RDBWilson病拷貝數(shù)變異簡單拷貝復(fù)雜拷貝片段分析PCR; TP-PCR; TP-msPCR; msPCR脆性綜合征大片段插入/缺失MLPA(連接酶依賴性探針擴(kuò)增)Gap-PCRDMD; SMA;CMT1A復(fù)雜的重排長片段PCRHA血友病一、直接診斷策略二、基因多態(tài)性連鎖分析檢測原理：多態(tài)性連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析檢測前提： 致病基因尚未被定位和闡明 基因太大 突變種類太多檢測方法：RFLP，STR，SNP三、基因突變的定量診斷檢測內(nèi)容：大范圍的重復(fù)、缺失檢測方法： 細(xì)胞分裂中期染色體檢測 固相雜交 PCR 擴(kuò)增方法分辨率(堿基數(shù))說明細(xì)胞分裂中

3、期染色體檢測染色體常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞分裂期染色；CGH5 x 106細(xì)胞分裂中期染色體作為探針來檢測和控制不同的雜交；FISH5 x 104用修飾（如纖維探針）來增強(qiáng)分辨率；陣列CGH5 x 104使用陣列化的細(xì)菌人工染色體載體（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而非細(xì)胞分裂中期染色體作為探針；MAPH不確定將探針與基因組DNA雜交，然后再擴(kuò)增探針；微衛(wèi)星PCR1 x 102取決于缺失區(qū)已知的微衛(wèi)星；差異PCR1 x 102要求精心控制起始DNA的質(zhì)和量，結(jié)果為相對量，是一種半定量方法；競爭PCR1 x 102準(zhǔn)確，結(jié)果為摩爾數(shù)，是一種絕對定量方法；R

4、eal-time PCR1 x 102成本較高，可有多種方法如Taqman法或分子信標(biāo)法的SYBR Green染料或探針，應(yīng)用越來越廣泛；長片段 PCR1 x 102檢測基因內(nèi)缺失比重復(fù)更有效，可以確定突變的性質(zhì)。產(chǎn)前診斷是在遺傳咨詢的基礎(chǔ)上，通過遺傳學(xué)檢測和影像學(xué)檢查，對高風(fēng)險的胎兒進(jìn)行鑒別診斷，對患胎采用選擇性流產(chǎn)，從而降低出生的缺陷率，有利于提高優(yōu)生質(zhì)量和人口素質(zhì)。臍血（24-28周）、羊水（16-20周）或者絨毛組織（9-11周）母血污染的問題無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷（NIPT, none invasive prenatal diagnosis）PGD(preimplatation geneti

5、c diagnosis) 單基因病遺傳病的分子診斷一、血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）二、血友?。╤emophilia )三、肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy)四、苯丙酮尿癥(phenylketonuria)五、囊性纖維化(Cystic fibrosis)六、亨廷頓病(Huntington Disease)七、脆性X綜合征(Fragile X syndrome) 血紅蛋白病血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，每個亞基可結(jié)合1個血紅素并攜帶1分子氧。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。 人類不同時期血紅蛋白的組成胚胎

6、期血紅蛋白：Hb Gower 1 （x2 e2 ）Hb Gower 2 (a2 e2)Hb Portland (x2 g2) 即Hb Portland 1另有少量Hb Portland 2 (x2 b2)，Hb Portland 3 (x2 d2)胎兒期主要血紅蛋白：HbF （a2 g2 ） 成人主要血紅蛋白：HbA （ a2 b2） 約占血紅蛋白總量96.597.5%HbA2 （a2 d2 ） 約占血紅蛋白總量2.53.5%HbF （ a2 g2） 約占血紅蛋白總量1%以下結(jié)構(gòu)異常血紅蛋白病 鐮刀狀細(xì)胞貧血； 不穩(wěn)定血紅蛋白病 血紅蛋白M病 氧親和力改變地中海貧血， 珠蛋白的合成降低或消失血

7、紅蛋白?。╤emoglobinopathy） 1、鐮刀形紅細(xì)胞貧血正常細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞鐮刀狀貧血病血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細(xì)胞，其攜帶氧的功能只有正常紅細(xì)胞的一半，患者常因此缺氧窒息。N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽鏈HbA 肽 鏈N-val his leu thr pro val glu C(146)鐮刀狀細(xì)胞貧血分子機(jī)制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAGGTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG分子診斷方法限制性內(nèi)切酶法（RE）ASOARMS、跨越斷裂點的PCR (裂口PCR、gap-PCR)S 肽鏈A肽鏈 AC

8、T CCT GAG GAGACT CCT GTG GAGRE法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT CASSA175268 443A肽鏈268 bp175 bp地中海貧血 地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一中國南方地中海貧血人群攜帶率Xu, et al. J Clin Pathol 2004, 57:517-22. Cai, et al. Chi J Epidemiol 2002,23:281-5. 病理和臨床特征 地中海貧血的血液學(xué)表型特征RBC 參數(shù) MCV MCH RDW Hb電泳分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts （4） Hb H (4) Hb

9、 E () 地中海貧血基因?qū)W特征地中海貧血的共同特點：由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，致使血紅蛋白的組成成分改變。地中海貧血主要分為-地中海貧血和-地中海貧血。-地中海貧血-地中海貧血（簡稱-地貧）是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈表達(dá)失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病。多由-珠蛋白基因的缺失突變所致。16p13.33-p13.11 每條16號染色體上有兩個Gene缺失程度不同，鏈合成部分或完全受到抑制，導(dǎo)致不同類型的地貧。 若一條染色體上缺失一個基因（ ）為+地貧，鏈合成減少。若一條染色體上兩個基因均缺失（ ）為0地貧，鏈不能合成。地中海貧血地貧的不同類

10、型的基因缺失 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion （ ） (- 4.2) Deletion （ ） (- 3.7) Deletion （ ）2 1研究發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)常見的3種 -地貧主要由 -SEA(東南亞缺失)、-3.7缺失(右缺失) 、 -4.2缺失(左缺失)引起。-地貧基因缺失示意圖-a3.7-a4.2-SEA21211P1 P2P3 P4 -珠蛋白基因型PCR產(chǎn)物片段長度 - 3.72.0kb P2=P3 1.8kb P3=P4 - 4.21.6kb P1=P4-SEA1.3kb P1=P2非缺失型-地貧概念： -基因發(fā)生點突變或

11、少數(shù)幾個堿基的缺失。中國常見的非缺失型突變：Hb CS 2 CD 142 TAACAA (Gln) Terminator mutation Hb QS 2 CD 125 CTGCCG (LeuPro) Unstable HbHb WS 2 CD 122 CACCAG (HisGln) Unstable Hb特點： 常發(fā)生于2基因，比缺失型導(dǎo)致更嚴(yán)重的珠蛋白鏈合成的減少。 a-地貧的基因型與表現(xiàn)型Normal (/) 正常+ thal trait (/-3.7)(/-4.2) 靜止型單一基因缺失或喪失功能臨床無任何癥狀，一般血液學(xué)檢查無異樣，僅平均紅細(xì)胞體積(MCV) 位于正常值下限。a-地貧的

12、基因型與表現(xiàn)型Hb H disease (- 3.7/-SEA)(- 4.2/-SEA)o Thal trait ( /-SEA) ( - / - )血紅蛋白H病3個基因缺失或喪失功能肝脾腫大，中度貧血。小細(xì)胞，低色素，HbH含量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血，癥重者甚至需切除脾臟。 標(biāo)準(zhǔn)型2個基因缺失或喪失功能臨床無癥狀，血液學(xué)檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細(xì)胞大小不均一，平均紅細(xì)胞體積(MCV) 及平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)明顯偏低。a -地貧的基因型與表現(xiàn)型Hb Barts Hydrops (-SEA/-SEA) Hb Barts 水腫胎兒綜合癥 4個基因缺失或喪失功能患胎于妊娠晚期或

13、產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合成亞基，臍血血紅蛋白（ Hb Barts ，4）含量高。a-地貧疾病嚴(yán)重程度的單倍型順序a2a1T a2- - a1a2Ta1 -a1T - -純合的-地貧基因型突變，為嚴(yán)重的HbH，偶可致胎兒水腫或者死亡-地中海貧血-地中海貧血是一種由于-珠蛋白基因突變導(dǎo)致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由-珠蛋白基因點突變所致。 在中國人群中常見的突變位點有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等。 1115.5EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Promoter mutationR

14、NA splicing Initiation mutationFrameshiftNonsense Poly(A) signal 地中海貧血的點突變b-地貧的基因型與表現(xiàn)型 重型-地中海貧血所有患者有組織缺氧癥狀，可出現(xiàn)“地中海貧血面容”，生長發(fā)育遲緩。紅細(xì)胞體積小且低色素。過剩的游離鏈形成鏈包涵體，引起溶血性貧血，靠輸血維持生命。/ 、0/ 0 、0/ （純合子或雙重雜合子） 輕型-地中海貧血患者癥狀較輕，輕度貧血，輕度肝脾腫大。紅細(xì)胞脆性降低，小細(xì)胞，低色素，MCV、MCH較低。/ 、/ 0 （雜合子）b-地貧的基因型與表現(xiàn)型 中間型-地中海貧血患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中度偏重貧

15、血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血液檢查呈小細(xì)胞低色素貧血癥。/ 、/ 0 （純合子或雙重雜合子）篩查的方法血常規(guī)MCV，MCH，RDWHb typingHbA2（血紅蛋白電泳，HPLC）基因診斷Gap-PCR反向斑點雜交Gap-PCR原理Location of primers and detection of -SEA deletion by gap-PCR-地中海貧血基因診斷結(jié)果判讀M. DNA Marker1. 未發(fā)生- 3.7、- 4.2、-SEA缺失2. 發(fā)生- 4.2缺失 雜合子3. 發(fā)生- 3.7缺失 雜合子4. 發(fā)生- 4.2缺失、-SEA缺失5. 發(fā)生- 3.7缺失、-SEA缺失6

16、. 發(fā)生-SEA缺失 雜合子 M 1 2 3 4 5 6 M -珠蛋白基因型PCR產(chǎn)物片段長度 - 3.72.0kb 1.8kb - 4.21.6kb-SEA1.3kb注：反向點雜交技術(shù)膜條顯色原理生物素鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物TMBH2O2固定在膜上的探針-地中海貧血基因診斷結(jié)果判讀41-42N654N28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M28M71-72M17MEM31MIVS1-1M43M32M29M30M14-15MCAPMIntMIVS1-5M發(fā)生654M、71-72M點突變 雙重雜合子發(fā)生17M點突變 雜合子發(fā)生EM點突變 純合子發(fā)生41-42M點突

17、變 雜合子-地中海貧血點突變基因診斷結(jié)果判讀未發(fā)生 QS、 CS、 WS點突變發(fā)生 WS點突變 雜合子發(fā)生 CS點突變 雜合子發(fā)生 QS點突變 雜合子 注： 純合子、雜合子，需結(jié)合-地中海貧血缺失型的結(jié)果來判斷地中海貧血的產(chǎn)前診斷意義針對的人群標(biāo)本的來源絨毛 羊水 臍血 宮頸脫落細(xì)胞 孕婦外周血胎兒細(xì)胞 外周血胎兒DNA什么是綜合診斷？綜合診斷的必要性？地中海貧血的綜合診斷血友病一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長，終身具有輕微創(chuàng)傷后出血傾向，重癥患者沒有明顯外傷也可發(fā)生“自發(fā)性”出血, 分為A,B,C三種。1.血友病A（血友病甲），即因子促凝成

18、分（：C）缺乏癥，也稱AGH缺乏癥，是一種X連鎖隱性遺傳疾病，女性傳遞，男性發(fā)病。2.血友病B（血友病乙），即因子缺乏癥，又稱PTC缺乏癥、凝血活酶成分缺乏癥，亦為X連鎖隱性遺傳，其發(fā)病數(shù)量較血友病A少。但本型中有出血癥狀的女性傳遞者比血友病A多見。3.血友病C（血友病丙），即因子（F）缺乏癥，又稱PTA缺乏癥、凝血活酶前質(zhì)缺乏癥。為常染色體不完全隱性遺傳，男女均可患病，是一種罕見的血友病。臨床表現(xiàn)1.出血（重型，中間型，輕型，亞臨床型）2.血腫的壓迫分子基礎(chǔ)1.血友病AF基因的缺陷導(dǎo)致F合成的障礙以及F分子結(jié)構(gòu)的異常引起F功能活性的降低或缺乏F基因位于X染色體長臂末端(Xq28) 包含186kb，約占X染色體全長的0.1%。外顯子26個，總長度約9kb。內(nèi)含子25個。mRNA長約9029bp,，引起血友病甲的F基因缺陷可以是點突變、基因的部分或全部缺失、基因成分插入、產(chǎn)生終止密碼的點突變和基因倒位。50%由于基因的倒位引起。診斷方法F功能活性的檢測LD-PCR,測序2.血友病BF 基因的缺陷導(dǎo)致F 合成的障礙以及F 分子結(jié)構(gòu)的異常引起F 功能活性的降低或缺乏。絕大