乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法奶粉阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)

1、乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法奶粉阪崎腸桿菌的檢驗(yàn) YLNB 4.71. 儀器及器材 水浴鍋：循環(huán)系統(tǒng)使溫度保持在45.50.2。水的高度應(yīng)高于浸入試管的中部。 浸入式溫度計(jì)：1-55，長度大約是55 cm，精確度為0.1。 培養(yǎng)箱：35-37C和 24-26C。 吸管：1、5和10 ml，精確度為0.1 ml。 L玻璃棒（如曲棍球棒狀）：直徑為3-4 mm.，可涉及45-55 mm的區(qū)域。 接種環(huán)：環(huán)的直徑為3 mm。 天平：量程為2 kg、精確度為0.1g。 滅菌樣品處理器具：取樣勺，剪刀，開罐器 樣品稀釋瓶：規(guī)格為100ml、125 ml、 160 ml、250 ml、2L1.10 菌落計(jì)

2、數(shù)器：或是其類似物，帶有放大鏡。1.11 API 20E生化鑒別系統(tǒng)。1.12 滅菌平皿：15 x 150 mm或直徑90mm。1.13 VITEK生化鑒定系統(tǒng)或類似設(shè)備。2. 培養(yǎng)基和試劑胰蛋白大豆瓊脂（TSA）：準(zhǔn)備好的中間體可在2-8C條件下貯存4周以上。 紫羅蘭紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBG瓊脂）：加該成分至1升蒸餾水中，（加經(jīng)過濾過的濃度為1%染液），加熱到沸騰并攪拌直到所有成分溶解為止。對該中間體不必進(jìn)一步消毒。冷卻到45C并倒入平皿中，平皿的直徑最好為15 cm。如果不是立即使用，貯存瓊脂在5-8 C。這個(gè)中間體在脫水情況下可以商業(yè)形式應(yīng)用(Oxoid, CM0485);可在容器中直

3、接激活使用。準(zhǔn)備好的中間體可在2-8C條件下貯存4周以上。酵母粉3.0 g蛋白胨7.0 g氯化鈉5.0 gNo. 3膽鹽1.5 g乳糖10.0 g中性紅0.03 g紫羅蘭結(jié)晶物0.002 g瓊脂15.0 g葡萄糖10.0g EE肉湯：加入干凈的公牛膽汁和亮綠防止對數(shù)量不多活力不強(qiáng)的腸細(xì)菌細(xì)胞造成抑制。溶解該成分在1升蒸餾水中，加熱到沸騰，然后分成90 ml的體積。這個(gè)中間體在脫水情況下可以商業(yè)形式應(yīng)用(Oxoid, CM0317); 可在容器中直接激活使用。準(zhǔn)備好的中間體可在2-8C條件下貯存4周以上。蛋白胨10.0 g葡萄糖5.0 g磷酸氫二鈉二水化合物8.0g磷酸二氫鉀2.0 g公牛膽汁2

4、0.0 g亮綠0.015 g2.4 氧化酶測試試劑：3. 方法：3.1 檢驗(yàn)程序：樣品100g加入900ml無菌蒸餾水 361 18-22h10ml加入90ml腸桿菌增菌肉湯（EE肉湯）361 18-22hVRBGA 361 18-22h或顯色培養(yǎng)基（Xa-GlcA）平板TSA平板251 48-72h361 18-22h革蘭氏染色 氧化酶試驗(yàn) API 20E生化鑒定試劑盒、VITEK生化鑒定系統(tǒng)或其他報(bào)告3.2檢驗(yàn)步驟 3.2.1取樣前消毒樣品包裝的開啟處和取樣勺。無菌稱取樣品100g至2L的樣品稀釋瓶中，加入900ml預(yù)熱到45的滅菌蒸餾水，或者將樣品直接稱量到裝有9倍預(yù)熱到45的滅菌蒸餾水

5、的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，361培養(yǎng)18-22h。3.2.2 移取培養(yǎng)18-22h的懸液10ml，加入90mlEE肉湯中，361培養(yǎng)18-22h。3.3.3輕輕混勻增菌液，用直接劃線法進(jìn)行平板接種：每份增菌液用3mm接種環(huán)（10ul）分別接種2個(gè)VRBGA平板或2個(gè)Xa-GlcA平板，三區(qū)法或四區(qū)法劃線，以得到單個(gè)菌落。將平板置361培養(yǎng)18-22h。3.3.4 觀察平板上阪崎腸桿菌的典型形態(tài)：在VRBGA平板上：紫色菌落周圍有一圈紫色的膽汁酸沉淀環(huán)，圓形，凸起，直徑2mm-3mm。（圖片來源于Sharon Edelson Mammel）在Xa-GlcA平板上：藍(lán)綠色菌落，圓形，直徑

6、1mm-2mm。3.3.5 在VRBGA平板上挑取5個(gè)可疑菌落分別接種到5個(gè)TSA平板，251 48-72h。典型菌落是黃色的（圖片來源于Sharon Edelson Mammel）3.3.6 從Xa-GlcA平板挑取5個(gè)可疑菌落，革蘭氏染色，做氧化酶試驗(yàn)。革蘭氏染色陰性，氧化酶陰性，應(yīng)用API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。3.3.7 從TSA平板上挑取黃色菌落，革蘭氏染色，做氧化酶試驗(yàn)。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，應(yīng)用API 20E生化鑒定試劑盒、VITEK生化鑒定系統(tǒng)或其他細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。3.3.8 腸桿菌屬細(xì)菌生化特性：試驗(yàn)生化特性阪崎腸桿菌E. sakazakii陰溝腸桿菌E. cloacae產(chǎn)氣腸桿菌E. aerogenes聚團(tuán)腸桿菌E. agglomerans葛高菲腸桿菌E. gergoviae賴氨酸脫羧酶-+-+精氨酸脫氫酶+-鳥氨酸脫羧酶+-+KCN, 生長中+v-發(fā)酵物 蔗糖+(+)+己六醇-(-)-(-)- 核糖醇-(-)+- 棉子糖+v+ D-山梨醇-+v- x-甲基-D-苷+(+)- D-阿拉伯糖醇-(-)+-+黃色素+-(+)-a Adapted from Farmer and Kelly, 1992.b +代表 90-100