(完整版)地區(qū)科學基金項目標書范例

1、國家自然科學基金申請書2008版第 頁版本1.006.348第 頁版本1.006.348申請代碼：C1401受理部門收件日期受理編號解除保護國家自然科學基金申請書（2008版）資助類別：地區(qū)科學基金項目亞類說明:附注說明:項目名稱：申請者：急性低血壓影響前庭功能的谷氨酸受體機制研究電話：依托單位:通訊地址:郵政編碼：133000單位電話：電子郵件:申報日期：2008年3月10日國家自然科學基金委員會基本信息zYleU7IM申請者信息名生i生出月年男男族鮮朝族民月2年859位學話電真?zhèn)黜摼W人個院學醫(yī)礎基學邊延號依托單位言息稱名碼代人系聯話電合作單位信息碼代目本息項基信影別類助資別類地基究研礎基費

2、經請申摘要通與、ZT受玖牡詰其rnr杉衽及判且V處氨敘氐和O治賄樹寸芟響師內)/N瞋免SS變VN功V存和砸壓V亠廷與范學M血期M并器理覽和時躺N酸W藥W黑V氨贓命,J調肘能匚谷化玉朋也山放方匕到rnr銅meu需碩霜施妣亦反n輕逼的蠟儀匪aa裁曲wOS誣-叮j質醒含F與和j皿bblm清時6參靜腐即41過在MD能Efi思發(fā)es通堀擁巧確證血又V壓扌胎層庭亍人TQIPOJE曷共請M/NRK示須凰申曲V疋勖首病而捱盯爲將疾一_，題fflsM,，瀉關W至V化IJ扳忻勿。變似Jr治豪清察號類為為JM不觀信見，并瞞尚內末頑制法胞尚據俵機方對細外依噴咻待兩和內酩很核但相和胳目劇:經，液劑気。性究)神關說效動酸

3、制關研字庭有假高激氨機相制O前放的、體口體的機W變釋節(jié)析受的受壓樞艮改的詢透析動其血中CK官酸壓量分活及低的器氨血微，舗質性節(jié)庭谷性用法功遞急調前與發(fā)，化N酸與壓過能繼期組V氨體血關鍵詞（用分號分開，最多5個）血壓，前庭損傷，前庭神經核，谷氨酸，受體2008版國家自然科學基金申請書2008版第 頁版本1.006.348第 頁版本1.006.348科目申請經費備注(計算依據與說明)研究經費18.50001科研業(yè)務費3.5000(1)測試/計算/分析費0.0000(2)能源/動力費0.0000(3)會議費/差旅費2.0000國際國內學術會各1次，(4)出版物/文獻/信息傳播費1.0000文獻復印、

4、文獻檢索、論文刊登費等(5)其它0.50002實驗材料費15.0000(1)原材料/試劑/藥品購置費12.0000動物1.5；免疫2.0；各種試劑3.5；流動相1.5；分離柱3.0；電極0.5(2)其它3.0000透析膜和各種導管1.5;其他消耗品1.53儀器設備費0.0000(1)購置0.0000(2)試制0.00004實驗室改裝費0.00005協作費0.0000二國際合作與交流費2.00001項目組成員出國合作交流1.0000選派1-2名項目組成員出國短期培訓和交流2境外專家來華合作交流1.0000聘請1名國外專家來華進行學術交流三勞務費3.3000研究生勞務費15%四管理費1.20005

5、%合計25.0000與本項目相關的其他經費來源國家其他計劃資助經費0.0000其他經費資助(含部門匹配)0.0000其他經費來源合計0.0000金額單位：萬元)經費申請表查看報告正文撰寫提綱國家自然科學基金申請書報告正文一、立項依據與研究內容研究意義：位于內耳的前庭器官中的半規(guī)管通過感知角加速運動，橢圓囊和球囊則通過感知線加速運動和重力刺激，導致反射性姿勢調節(jié)。即末梢前庭感受器感知頭部的運動，把傳入信號經前庭神經傳達到前庭神經核(vestibularneucler,VN)后，誘發(fā)前庭-眼球反射；前庭-脊髓反射；前庭-自主神經反射。關于前庭-自主神經反射中，目前很多研究主要集中在對前庭器官的過度

6、刺激或單側前庭器官損傷所致惡心、嘔吐、眩暈、心率加快、出汗等自主神經癥狀上。有文獻報道，參與血壓調節(jié)的前庭-自主神經反射是末梢前庭感受器的傳入信號到達VN后，通過多種中樞神經通路從延髓吻側腹外側區(qū)神經元傳達到交感神經，構成作用于心臟和血管的神經傳導徑路。眾所周知，前庭器官通過感知頭部運動后參與血壓的調節(jié)。但是，血壓的變化對前庭器官功能的影響方面研究甚少。原發(fā)性低血壓、心衰、心梗、心率不齊患者常伴有眩暈癥狀，但其發(fā)生機制并不確切。目前認為可能也與末梢前庭感受器的血流變化有關。血壓的降低常常引起眩暈，提示末梢前庭感受器可能對血壓的變化起反應，并可能參與繼發(fā)性血壓調節(jié)。本實驗室利用電生理學和免疫組織

7、化學方法，在麻醉動物發(fā)現急性低血壓不僅改變前庭神經和VN細胞的自發(fā)放電活動，而且也能增加VN神經細胞內細胞8興奮標志物pERKI/2蛋白和c-Fos基因的表達、增加谷氨酸的含量，這些變化可被破壞前庭器官所反轉。考慮急性低血壓時前庭器官的功能改變與前庭神經釋放谷氨酸有關，設想若能在清醒動物觀察誘發(fā)急性低血壓時結合藥理學方法，觀察VN區(qū)的谷氨酸、pERK1/2和c-Fos的變化，將有助于闡明前庭器官參與血壓變化引起的繼發(fā)性血壓調節(jié)和血壓變化所致眩暈的谷氨酸及其受體機制。谷氨酸的受體有促離子型受體和促代謝型受體，他們被激活后通過細胞內各級酶的級鏈磷酸化反應或通過調控基因表達改變細胞的功能活動。但是尚

8、無在血壓變化時谷氨酸通過什么受體影響VN細胞功能的相關研究報道。本研究為了闡明血壓的變化通過前庭系統繼發(fā)性地參與血壓調節(jié)和急性低血壓、心衰、心梗、直立性低血壓患者常伴有的眩暈癥的谷氨酸受體機制，在清醒自由活動大鼠，利用核團微量透析、高效液項分析、藥理學、免疫組化和行為學等方法，觀察正常和破壞一側外周前庭器官不同時期，誘發(fā)急性低血壓時VN內谷氨酸含量、PERK1/2和c-Fos基因的變化和動物行為的改變。國內外研究現狀：1974年Doba等首次報道前庭器官參與直立性低血壓的調節(jié)后，開始了對前庭-自主反射的研究。發(fā)現刺激前庭器官可使呼吸變得急促、心律加快、血流重新分布1-2，并參與動脈血壓的調節(jié)3

9、。那么，血壓是否也會影響前庭系統的功能活動？有學者指出4，基底動脈短暫缺血性眩暈患者腦干聽力誘發(fā)電位也受到抑制，而且老年性眩暈癥的90%以上是由于腦血管缺血所致5。但是尚無內臟功能尤其是血壓變化也影響前庭功能的直接報道。根據用硝酸甘油（sodiumnitroprusside,SNP）引起低血壓和腦血流量改變的相關研究發(fā)現，SNP使血壓降低50%以上時腦血流量明顯減少，而血壓降低不足50%時腦血流量不出現明顯變化，但是耳蝸的血流量隨著血壓的降低成比例減少。認為血壓降低10%30%時腦血流量并不降低，只改變了前庭器官的血流量。推測這是血壓降低可能通過激活VN使體循環(huán)血壓反射性升高的一種代償性反應，

10、提示前庭器官可能繼發(fā)性地參與血壓的調節(jié)。我們的研究7-11也發(fā)現，SNP誘發(fā)急性低血壓改變前庭傳入神經和VN神經元的自發(fā)放電活動，并增加VN內c-Fos基因表達，這種作用被破壞外周前庭器官所反轉。由圖1可見急性低血壓增強VN內I型神經元的活動，卻使U型神經元的活動則有降低傾向，而在破壞單側前庭感受器后這種現象發(fā)生反轉。VN內c-Fos表達實驗又發(fā)現（圖2），正常動物誘發(fā)急性低血壓引起兩側VN內c-Fos基因表達明顯增加，破壞單側前庭器官的動物損傷側VN內c-Fos表達并不增加。Kim憶等又報道，失血性急性低血壓增加VN內pERK1/2表達，破壞前庭器官時pERK1/2表達則明顯減少。提示，血壓

11、的降低可以通過前庭器官和VN引起前庭反應，其中有前庭感受器的參與，而且前庭器官的刺激不僅影響血壓，反過來血壓的變化也能影響前庭器官的活動。這種活動可能意味著急性低血壓通過前庭器官參與繼發(fā)性的血壓調節(jié)。VN區(qū)的神經遞質種類繁多，其中至少有谷氨酸可能作為前庭傳入神經的初級神經遞質或調質發(fā)揮作用13。有文獻報道，前庭代償與其末梢釋放谷氨酸及其離子型和代謝型受體14，也與GABA遞質有關，而在前庭-眼球反射時前庭器官的傳入神經到達VN后其末梢釋放的遞質中有氨基酸類遞質（谷氨酸、天冬氨酸、GABA）16。本室的最近研究發(fā)現17，用藥物或放血等方法在麻醉大鼠誘發(fā)急性低血壓時，正常動物VN內谷氨酸的含量明顯

12、增加而牛黃酸含量明顯減少，但是損傷單側前庭器官動物慢性期損傷側VN內谷氨酸和牛黃酸含量沒有明顯變化。表明急性低血壓興奮末梢前庭感受器，使其傳入信號傳達到VN后分泌谷氨酸來改變VN神經元的活動。國家自然科學基金申請書2008版國家自然科學基金申請書2008版第 頁版本1.006.348第 頁版本1.006.348申請人的預實驗已經發(fā)現18，在清醒無麻醉正常大鼠誘發(fā)急性低血壓時，VN谷氨酸含量明顯增加而牛磺酸含量卻明顯降低。這種現象在一側迷路損傷慢性期，損傷側VN區(qū)谷氨酸含量則無明顯變化，但是?；撬岷咳匀幻黠@下降，而在健康側VN內谷氨酸和?；撬岷慷济黠@增加(圖3和4)。但是到目前為止，尚未見到

13、關于急性低血壓通過興奮外周前庭器官，其末梢釋放谷氨酸等氨基酸類遞質以后，通過何種受體改變VN的功能活動的研究報道。主要參考文獻：WilsonTD,CotterLA,DraperJA,etal.Vestibularinputselicitpatternedchangesinlimbbloodflowinconsciouscats.JPhysiol.2006Sep1;575(Pt2):671-84.T.D.Wilson,L.A.Cotter,J.A.Draper，etal.Effectsofposturalchangesandremovalofvestibularinputsonbloodflow

14、totheheadofconsciousfelines.JApplPhysiol.2006,100:1475-1482,GotohTM,FujikiN,MatsudaT,etal.Rolesofbaroreflexandvestibulosympatheticreflexincontrollingarterialbloodpressureduringgravitationalstressinconsciousrats.AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol2004.286:R25-R30,唐開雄，陳瑞陶，蔡瑞等.椎基底動脈短暫缺血性眩暈患者腦血流量與腦干聽力誘發(fā)電關系

15、研究華西醫(yī)大學報2000,31(1):8081殷國華.老年人眩暈的病因分析.山東醫(yī)大基礎醫(yī)學院學報.2001,l5(6);328-330HamaguchiM,IshibashiT,KatsumataN,etal.Effectofsodiumnitroprusside(MR7S1)andnitroglycerinonthesystemic,renalcerebralandcoronarycirculationofdogsanesthetizedwithenfluranee.CardiovascDrugsTher.1992;6:611-622ByungRimPark,MinSunKim,Ggueh

16、ynYee,etal.Changesinvestibularnerveactivityfollowingacutehypotensioninrats.KoreanJphysiolpharmacol.2003,7;85-89MinSunKim,JaeHyoKim,Davykry,etal.EffectsofacutehypotensiononexpressionofcFos-likeproteininthevestibularnucleiofrats.BrainResearch.2003,962:111-12；MinSunKim,JaeHyoKim,YuanZheJin,Davykry,Byun

17、gRimPark.TemporalchangesofcFos-likeproteinexpressioninmedialvestibularnucleifollowingarsanilate-inducedunilaterallabyrinthectomyinrats.NeuroscieneeLetters.2002,319:9-12YuanZheJin.GuangShiJin.MinSunKim.ByungRimPark.Roleofcentralvestibularpathwayoncontrolofbloodpressureduringacutehypotensioninrats.JKo

18、reanBalaneeSoc.2005:4(2):189-200ParkBR,KimMS,KimJH,JinYZ.Effectofacutehypotensiononneuronalactivityofvestibularnucleiinrats.Neurorport.2001,12.3821-3824.MinSunKim,MyounAeChoi,DongOkChoi,etal.Asymmetricactivationofextracellularsingal-regulatedkinase1/2inratvestibularnucleibyunilaterallabyrinthectomy.

19、Brainresearch.2004,1011;238-242.SasaM,TakeshitaS,AmanoT,etal.Primaryneurotransmittersandregulatorysubstancesontovestibularnucleusneurons.BiolSciSpace.200115(4):371-4GliddonCM,SansomAJ,SmithPF,etal.Effectsofintra-vestibularnucleusinjectionofthegroupImetabotropicglutamatereceptorantagonistAIDAonvestib

20、ularcompensationinguineapigsExpBrainRes,2000,134(1)：74-80.GiardinoL,ZanniM,FernandezM,etal.PlasticityofGABA(a)systemduringageing:focusonvestibularcompensationandpossiblepharmacologicalintervention.BrainRes.2002Mar1;929(1):76-86AndrianovGN,PuyalJ,RaymondJ,etal.Immunocytochemicalandpharmacologicalchar

21、acterizationofmetabotropicglutamatereceptorsofthevestibularendorgansinthefrog.HearRes.2005,204:200-209.于海玲、安英、邴艷華、金清華、崔勛、金元哲*急性低血壓對前庭神經內側核區(qū)谷氨酸和牛磺酸含量的影響.生理學報.2006，58(2)177-182.安英，于海玲，邴艷華，金清華，崔勛，金元哲*急性低血壓對清醒大鼠前庭神經內側核區(qū)谷氨酸和牛磺酸含量的影響。中國臨床康復.2006;10(30):82-852項目的研究內容、研究目標，以及擬解決的關鍵問題。研究內容：本研究擬用清醒大鼠，藥物或外科手術制

22、備外周前庭器官損傷模型后，用核團內微量透析、高效液相色譜、免疫組織化學、藥理學、行為學等方法，探討急性低血壓興奮VN時VN內谷氨酸等氨基酸類神經遞質含量的變化及谷氨酸受體機制。將有助于闡明血壓影響前庭功能，并繼發(fā)性地參與血壓調節(jié)的谷氨酸及其受體機制，并為臨床治療相關疾病提供新的思路。實驗動物選用250-300g的清潔級Wistar系雄性大鼠，在清醒狀態(tài)下進行實驗。誘發(fā)急性低血壓用靜脈注射SNP（15卩g/kg/min,3mir）,使動脈血壓下降30%左右。為了研究前庭代償的不同時期，急性低血壓對VN區(qū)神經遞質含量變化的相關性，實驗分前庭感受器損傷后急性期（24,48小時）和慢性期（兩周后）兩個

23、部分進行。外周前庭器官的永久破壞用對氨基苯基砷酸鹽行化學性損毀法或外科手術損毀法。（1）正常清醒動物VN區(qū)谷氨酸含量、pERK1/2和c-Fos的表達。利用神經核團微量透析法和免疫組織化學法，觀察VN內谷氨酸等氨基酸類神經遞質含量、PERK1/2和c-Fos的表達。明確正常清醒動物VN內氨基酸類遞質的含量和細胞興奮標志物的表達情況。（2）急性低血壓對正常清醒動物VN區(qū)谷氨酸含量、PERK1/2和c-Fos表達的影響。觀察正常清醒動物誘發(fā)急性低血壓時,VN內神經遞質含量變化、PERK1/2和c-Fos的表達。證實本實驗條件下，急性低血壓是否興奮VN,同時證明谷氨酸參與其中。（3）前庭損傷不同時期

24、急性低血壓對清醒動物VN區(qū)神經遞質含量、pERK1/2和c-Fos表達的影響。一側前庭損傷急性期（損傷24、48小時）和慢性期（損傷2周），觀察誘發(fā)急性低血壓前后雙側VN區(qū)神經遞質、PERK1/2和c-Fos的表達差異。闡明前庭損傷不同時期（A）VN內上述指標的變化；（B）急性低血壓與上述指標的關系。（4）受體興奮劑和阻斷劑對前庭損傷不同時期清醒動物VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的影響。側前庭器官損傷后的不同時期用藥理學和免疫組織化學法，腦室注入受體興奮和阻斷劑（如谷氨酸和谷氨酸的拮抗劑Dizocilpine,MK-801等）后比較觀察正常和損傷前庭動物雙側VN內pERK1/2和c-Fo

25、s表達變化。進一步闡明前庭損傷不同時期受體興奮劑和阻斷劑對VN不對稱興奮的影響。同時通過動物行為變化，觀察興奮劑和阻斷劑對前庭失代償行為的影響。（5）受體興奮劑和阻斷劑對前庭損傷不同時期清醒動物誘發(fā)急性低血壓后VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的影響。側前庭器官損傷后的不同時期，誘發(fā)急性低血壓前后觀察損傷側和健側VN內pERKI/2和c-Fos的表達，比較分析兩側的差異。確定前庭損傷不同時期，急性低血壓影響VN功能受體功能變化。最終驗證急性低血壓興奮外周前庭器官，通過前庭神經至少釋放谷氨酸并通過相應受體改變VN功能的假說，同時闡明前庭損傷不同時期這些遞質和受體功能變化的相關性。研究目標:1闡

26、明一側前庭損傷不同時期，兩側VN區(qū)谷氨酸含量變化的相關性。2在正常清醒動物，通過誘發(fā)急性低血壓，觀察VN內神經遞質含量變化，證明急性低血壓與VN內谷氨酸含量變化的相關性。通過pERK1/2和c-Fos表達變化證明急性低血壓興奮VN。側前庭器官損傷的清醒動物,通過誘發(fā)急性低血壓觀察前庭器官損傷不同時期動物雙側VN內神經遞質含量的變化，證明前庭損傷不同時期急性低血壓與VN內谷氨酸含量變化的相關性。同樣通過PERK1/2和c-Fos表達變化，闡明前庭損傷不同時期急性低血壓前后VN功能活動變化。使用受體興奮劑或阻斷劑后,觀察一側前庭器官損傷的清醒動物VN內pERKI/2和c-Fos表達的影響，闡明側前

27、庭損傷后，前庭代償不同時期VN的興奮與相應受體的關系。通過動物行為變化，觀察興奮劑和阻斷劑對前庭失代償行為的影響。5使用受體興奮劑或阻斷劑后，觀察急性低血壓對一側前庭器官破壞動物VN內pERKI/2和c-Fos表達的影響，確定前庭損傷不同階段參與急性低血壓興奮VN的谷氨酸受體功能變化。擬解決的關鍵科學問題:1明確清醒動物VN區(qū)谷氨酸等氨基酸類遞質的含量；2闡明清醒動物急性低血壓興奮VN的谷氨酸的受體機制；3闡明清醒動物前庭損傷不同時期，急性低血壓與VN的谷氨酸含量及其受體功能的關系；4.揭示清醒動物側外周前庭器官損傷不同時期，前庭代償與谷氨酸含量及其受體的相互關系；3擬采取的研究方案及可行性分

28、析。擬采取的研究方法和實驗手段：動物：本實驗選用250-300g的清潔級Wistar系雄性大鼠。為了消除麻醉對動物心理和行為的影響，實驗觀察全部在清醒狀態(tài)下進行。(2)破壞前庭器官：外周前庭器官的永久破壞行化學和手術損毀法?；瘜W損毀法：水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉。從外耳穿透鼓膜向中耳注入對氨基苯胂酸鹽(sigma公司產品，用0.3M碳酸鈉溶液配成100mg/ml)后放入脫脂棉，并置動物仰臥位，使藥物持續(xù)緩慢吸收?？墒箘游镌?個小時后開始出現前庭損傷癥狀。手術損毀法：水合氯醛麻醉，在耳廓后去毛，常規(guī)消毒，暴露顳骨下緣、鉆開骨緣，露出水平半規(guī)管，抽吸外淋巴液，并用聚乙烯管向前庭壺腹處

29、灌注無水酒精后留管，縫合皮膚，肌肉注射抗生素。血壓記錄和誘發(fā)急性低血壓：水合氯醛麻醉下，行股動、靜脈插管，動靜脈導管從后背皮下穿到頭部。動脈導管連接BL-420E+型生物機能實驗系統，監(jiān)測血壓。靜脈注射SNP(15/kg/min,3min)誘發(fā)低血壓，使血壓約下降30%。植入微量透析探針外套管：水合氯醛麻醉。參照大鼠腦圖譜，在VN內側核投射區(qū)將透析膜的外套管插入到VN區(qū)(后囟向后2.429mm,正中線旁開0912mm,深度6.570mm)后牙托粉固定。最后用直徑1cm的套管套住動靜脈管和透析膜的外套管，周圍用牙托粉固定。動物手術均在常規(guī)消毒下進行，待24小時后進行透析液的收集。腦部微量透析法：

30、動物乙醚麻醉，透析膜外套管內插入透析探針。作用透析膜為醋酸纖維膜，有效長度15mm,外徑200ym，接觸部位用臘封。微量透析探針(圖5)通過透析用外套管插入到VN內固定。把改良林格液用微量灌流泵向大鼠VN區(qū)經透析管以1.5卩l(xiāng)/min速度灌流，同時經樣本收集器收集樣本，每管收集10min，收集量為15門-80C冷凍，以備神經遞質含量分析。實驗結束后取腦固定、60叩連續(xù)冰凍切片，中性紅染色，光鏡下進行組織學鑒定。清醒動物慢性記錄法：將動物置于特制的電腦控制圓形代謝籠(直徑為28cm；高度28cm)內飼養(yǎng)，在代謝籠內大鼠可自由活動。該方法能夠使為了進行各種記錄所設置的導管因動物的活動所致的扭轉信息

31、經傳感器傳送給電腦，通過電腦使代謝籠向反方向旋轉使導管恢復正常，保證實驗過程中記錄用各種導管暢通(圖6)。VN區(qū)透析液的神經遞質分析：生物活性物質微量分析系統(MicrodialysisTotalSystemDTA-300和HTEC-500.Eicom.Japan)利用內置的高效液相色譜分析儀，連續(xù)、自動地、經過分離柱和電化學電極一次性測量樣品中待測的包括谷氨酸的氨基酸類神經遞質。受體阻斷劑或興奮劑的使用：為了探討急性低血壓通過前庭神經釋放谷氨酸興奮VN的受體機制，腦室或核團微量給與相應受體興奮劑和阻斷劑(如谷氨酸和拮抗劑Dizocilpine,MK-801)。免疫組織化學法：利用免疫組化法研

32、究VN內pERK1/2和c-Fos的表達。正常和誘發(fā)急性低血壓后5-10min以內，動物深麻醉、利用4c左右的01%PBS緩沖液灌流心臟、0.1%PBS緩沖液稀釋的4%多聚甲醛溶液灌流、剝離腦組織，4%多聚甲醛溶液室溫固定、30%的蔗糖溶液脫水，40m冰凍切片，按著相關要求進行免疫學反應(略)、染色，利用圖象分析儀分析。技術路線:選擇動物基礎狀態(tài)下VN區(qū)谷氨酸c-Fos表達v、c-Fos）.受體激動/陽斷劑對雙側VN區(qū)低血壓效應影響（碎H町VW起叭|JrH-5-.pCTXTVVN、cFos）技術路線方框圖1動物的選擇：利用升降姿勢反射和旋轉實驗選擇前庭功能正常、體重在250-300g的清潔級W

33、istar系雄性大鼠；2動物狀態(tài)：以清醒狀態(tài)自由活動大鼠為研究對象，在電腦控制代謝籠中飼養(yǎng)并進行各項實驗；3破壞前庭器官：（詳見研究方法和實驗手段），實驗觀察分前庭器官破壞急性期和慢性期進行；4誘發(fā)急性低血壓：靜脈注射SNP使血壓約下降30%。5前庭損傷急性期實驗（一側前庭損傷4、48小時后）：（1）單純低血壓對清醒動物VN區(qū)各種神經遞質含量的影響：動物腹腔注射水合氯醛麻醉、留置微量透析探針外套管、動靜脈插管，待動物蘇醒后代謝籠內飼養(yǎng)，并穩(wěn)定24h以上；乙醚麻醉、微量透析探針外套管內插入透析探針，并與動靜脈插管一起連上實驗記錄系統；每隔10min鐘收集前庭正常動物VN區(qū)灌流液3次，測定和分析灌

34、流液中神經遞質含量(以這3個含量的平均值作為對照值，比較分析誘發(fā)急性低血壓后VN區(qū)各種神經遞質含量的變化百分比。下同)；靜脈注射SNP誘發(fā)急性低血壓后，每隔10min鐘收集灌流液6次，測量灌流液中神經遞質含量，比較分析與誘發(fā)低血壓前對照值的差異和隨時間的變化；單純低血壓對清醒動物VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的影響：動物腹腔注射水合氯醛麻醉、動靜脈插管，待動物蘇醒后代謝籠內飼養(yǎng)，并穩(wěn)定24h以，乙醚麻醉、動靜脈插管連上實驗記錄系統；分別于SNP誘發(fā)急性低血壓后，3、5、7、9min時，進行動脈灌流固定腦組織、冰凍切片、免疫組化反應，比較分析與對照組VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的差

35、異；低血壓對損傷一側外周前庭器官動物VN區(qū)各種神經遞質的影響：同5(1)的；水合氯醛麻醉、手術破壞外周前庭器官；在誘發(fā)急性低血壓實驗前24h時，乙醚麻醉、留置微量透析探針外套管內插入透析探針，并與動靜脈插管一起連上實驗記錄系統，代謝籠飼養(yǎng)；分別在破壞前庭器官24h和48h時，每隔10min鐘收集誘發(fā)急性低血壓前NV區(qū)灌流液3次，測定和分析灌流液中神經遞質含量；靜脈注射SNP誘發(fā)急性低血壓后，每隔10min鐘收集灌流液6次，分別測量雙側VN區(qū)灌流液中神經遞質含量，比較分析與急性低血壓前后，雙側VN內的差異和隨時間的變化；低血壓對損傷一側外周前庭器官動物VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的影響：

36、同5(2)的；破壞外周前庭器官，同5(3)的。連續(xù)觀察動物行為學指標的變化(3周)；同(2)的和；受體興奮劑和阻斷劑的效應：動物腹腔注射水合氯醛麻醉、動靜脈插管、側腦室留置注射用外套管，待動物蘇醒后代謝籠內飼養(yǎng)，并穩(wěn)定24h以上;乙醚麻醉、注射用外套管內插入注射管，并與動靜脈插管一起連上實驗記錄系統，穩(wěn)定1h后，腦室注射受體興奮劑或阻斷劑；觀察動物行為學指標；同5(2)的和；6前庭損傷慢性期實驗(一側前庭損傷2周后)：低血壓對一側損傷前庭器官動物VN區(qū)各種神經遞質影響：水合氯醛麻醉、手術或化學損傷前庭器官2周后進行實驗；收集VN區(qū)灌流液前1天，再次水合氯醛麻醉、留置微量透析探針外套管、動靜脈插

37、管，待動物蘇醒后代謝籠內飼養(yǎng)，并穩(wěn)定24h以上；乙醚麻醉、插入透析探針，并與動靜脈插管一起連上實驗記錄系統；每隔10min鐘收集前庭正常動物NV區(qū)灌流液3次，測定和分析灌流液中神經遞質的成分和含量；誘發(fā)低血壓后，每隔10min鐘收集灌流液6次，測量灌流液中神經遞質含量，比較分析與誘發(fā)低血壓前對照值的差異和隨時間的變化；低血壓對一側損傷前庭器官動物VN區(qū)pERK1/2和c-Fos表達的影響：同6(1)的；乙醚麻醉、動靜脈插管連上實驗記錄系統；分別于誘發(fā)低血壓后，3、5、7、9min時，進行動脈灌流固定腦組織、冰凍切片、免疫組化反應，比較分析與對照組NV區(qū)pERK1/2s和c-Fo表達的差異；受體

38、興奮劑和阻斷劑的效應：同6(1)的；乙醚麻醉、注射用外套管內插入注射管，并與動靜脈插管一起連上實驗記錄系統，穩(wěn)定1h后，腦室注射受體興奮劑或阻斷劑；觀察動物行為學指標；同6(2)的；關鍵技術：1在清醒動物，誘發(fā)急性低血壓和收集前庭神經核灌流液的過程中保證各記錄系統管道的暢通；2精密制備規(guī)格一致的透析用探針；3短時間內用免疫組化法測定pERK1/2和c-Fos表達;4.VN準確定位；可行性分析已有研究證明，血壓的變化通過前庭神經傳入到VN后，通過多種中樞神經通路從延髓吻側腹外側區(qū)神經元傳達到交感神經，構成作用于心臟和血管的神經傳導徑路，而且前庭器官通過感知頭部運動后參與血壓的調節(jié)。另外原發(fā)性低血

39、壓、充血性心衰、心梗、心率不齊患者常伴有眩暈癥狀，但其發(fā)生機制并不確切。認為可能與末梢前庭感受器的血流變化有關，并可能參與繼發(fā)性血壓調節(jié)。我們在麻醉動物發(fā)現，急性低血壓可通過改變前庭神經和VN細胞的自發(fā)放電、增加VN內pERKI/2和c-Fos的表達，這些變化可被破壞前庭器官所反轉。見于VN內有谷氨酸，并受前庭傳入沖動的影響，推測急性低血壓可能通過谷氨酸和相應受體改變前庭系統的功能活動。我們的預實驗已經檢測到清醒動物誘發(fā)急性低血壓時，VN谷氨酸含量明顯增加而?；撬岷繀s明顯降低。這種現象在一側迷路破壞后同側VN區(qū)谷氨酸含量則無明顯變化，但是牛磺酸含量仍然明顯下降，而在健康側VN內谷氨酸和?；撬?/p>

40、含量都明顯增加（圖3和4）。根據申請人的前期實驗發(fā)現，急性低血壓確實通過外周前庭器官激起傳入神經興奮VN，且其末梢釋放的遞制中有谷氨酸遞質，結合我室在前庭代償和誘發(fā)動物急性低血壓對VN區(qū)氨基酸類遞質含量的研究基礎，又已經培養(yǎng)了1名博士生和3名碩士生，發(fā)表了相關的研究論文多篇。現又承擔一項教育部科技司博士點專項基金前庭代償中前庭神經核內中樞化學機制研究（2070184002,2007.12-2009.12。還具備比較完善的血壓記錄系統多套、電腦控制代謝籠、冷凍切片機、腦內微量物質分析系統2套、圖象分析儀。用于實驗的各種消耗品和試劑來源充足，有關技術完全過關。另外每年從韓國的圓光大學校醫(yī)科大學的生

41、理學教研室能夠得到價值人民幣1-2萬元的相關消耗品。鑒于有上述實驗條件和研究基礎可以保證本項研究的順利進行。4.本項目的特色與創(chuàng)新之處（1）科學意義：經過檢索和查新，除了申請人的研究以外在國內外尚未發(fā)現類似的研究。本研究提出，急性低血壓興奮前庭神經，通過其末梢至少釋放谷氨酸并通過相應受體改變VN的功能活動，進而參與繼發(fā)性血壓的調節(jié)假說。(2)方法學：首次在清醒大鼠靜脈注射SNP誘發(fā)急性低血壓后，結合微量透析、高效液相色普、免疫組織化學等方法，觀察急性低血壓時VN區(qū)谷氨酸含量、pERK1/2和c-Fos等細胞興奮標志物質表達變化，同時結合藥理學方法研究其受體機制。5年度研究計劃、預計研究結果年度

42、研究計劃：2009年1月-2009年12月：測量前庭功能正常動物VN區(qū)神經遞質、pERK1/2和c-Fos含量；誘發(fā)急性低血壓后，觀察VN區(qū)神經遞質、pERK1/2和c-Fos含量變化；損傷一側前庭器官急性期(損傷24和48h,下略)，觀察健側和損傷側VN區(qū)神經遞質、pERK1/2和c-Fos含量的變化。同時觀察動物行為學指標的變化；損傷一側前庭器官急性期誘發(fā)急性低血壓后，觀察健側和損傷側VN區(qū)神經遞質、pERK1/2和c-Fos含量的變化；分析資料，撰寫論文。2010年1月-2010年12月：損傷一側前庭器官急性期，腦室注射相應受體激動劑和阻斷劑后，觀察動物行為學指標的變化；損傷一側前庭器官

43、急性期，腦室注射相應受體激動劑和阻斷劑后誘發(fā)急性低血壓，觀察健側和損傷側VN內pERK1/2、c-Fos含量的變化；損傷一側前庭器官慢性期(損傷2周，下略)，觀察健側和損傷側VN區(qū)部分神經遞質和pERK1/2、c-Fos含量的變化。同時觀察動物行為學指標的變化；損傷一側前庭器官慢性期誘發(fā)急性低血壓后，觀察健側和損傷側VN區(qū)神經遞質、pERK1/2和c-Fos含量的變化；分析資料，撰寫論文。2011年1月-2011年12月：（1）損傷一側前庭器官慢性期，腦室注射相應受體激動劑和阻斷劑后，觀察動物行為學指標的變化;（2）損傷一側前庭器官慢性期，腦室注射相應受體激動劑和阻斷劑后誘發(fā)急性低血壓，觀察健

44、側和損傷側VN內pERK1/2、c-Fos含量的變化；（3）補充實驗；（4）資料分析、撰寫論文。預期研究結果：確定清醒動物VN區(qū)谷氨酸等氨基酸類神經遞質的含量；闡明清醒動物急性低血壓興奮VN的谷氨酸和受體機制；揭示清醒動物一側外周前庭器官損傷后不同時期前庭代償與谷氨酸含量、谷氨酸受體的關系；進一步提出急性低血壓和前庭代償與VN其他神經遞質方面的新課題；5公開發(fā)表23篇系列研究論文；6培養(yǎng)1名博士生和23名碩士生；二、研究基礎與工作條件1.工作基礎：申請人從1982年一直從事神經生理學研究。2000-2003年留學韓國圓光大學校醫(yī)科大學生理學教研室時，在前庭生理學領域探討了前庭器官與循環(huán)器官的關

45、系及其機制。最近在“ActaPhysiologicaSinica發(fā)表了急性低血壓對前庭神經內側核Gul和Tau含量的影響，Roleofcentralvestibularpathwayoncontrolofbloodpressureduringacutehypotensioninrats等前庭生理學方面論文10余篇，其中3篇收錄于SCI。發(fā)表了藍斑核在室旁核心血管活動調節(jié)中的作用，刺激大鼠藍斑核時對胃電和胃運動的影響，藍斑核對大鼠迷走-迷走胃抑制反射的影響等神經生理學方面研究論文20余篇。藍斑核對胃運動調節(jié)的研究1991年授予教育部科學進步二等獎。2007年前庭代償中前庭神經核內中樞化學機制研究

46、得到教育部博士點科研基金資助。2004年吉林省科技廳杰出青年課題血壓影響前庭功能的中樞化學機制。另外，申請人與韓國圓光大學校醫(yī)科大學生理學教研室有著密切的業(yè)務聯系，該教研室的主任教授、博士生導師、美國和韓國平衡學會常務理事樸柄林老師每年一合作的形式資助人民幣2萬元左右的實驗試劑，待實驗結束后可以在國外刊物上發(fā)表高水平的論文。另外申請人的預實驗結果發(fā)現，在清醒無麻醉大鼠誘發(fā)急性低血壓時，VN谷氨酸含量明顯增加而?；撬岷繀s明顯降低。這種現象在一側迷路破壞后同側VN區(qū)谷氨酸含量則無明顯變化，但是?；撬岷咳匀幻黠@下降，而在健康側VN內谷氨酸和?；撬岷慷济黠@增加（圖3和4）。本教研室的副教授（另有

47、自然基金課題）自1996-2001年在日本宮崎醫(yī)科大學第一生理教研室留學，獲得博士學位。她目前主要從事室旁核參與心血管中樞調節(jié)的神經化學機制研究，利用清醒動物慢性記錄法、腦部微量透析法、高效液相色譜法等實驗技術，系統地研究了參與應激反應時NE、NO、谷氨酸等神經遞質的作用。其研究成果主要發(fā)表在Am.J.Physol、BrainReseach等國際刊物上，共9篇，均收錄于SCI。2工作條件：實驗室條件：本生理學教研室是吉林省教育廳和衛(wèi)生廳的重點學科，吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研基地三級實驗室，吉林省衛(wèi)生廳重點研究室神經生物研究室。2000年國務院學位委員會批準為博士學位授予權點。已經2次得到教育

48、部211工程建設九五和十五”的建設。2005年8月又被成為教育部省部共建國家重點實驗室長白山天然資源與功能因子實驗室的成員學科。目前本實驗室具有澳大利亞埃德儀器公司生產的綜合生理分析系統ML785PowerLab/8sp和ML845PowerLab4/25系統各一臺、日本Eicom公司的EicomHTEC-500生物活性物質微量分析系統2臺、電腦控制代謝籠、冷凍切片機、圖象分析系統和400余平方米的實驗室。每年招收810名研究生和45名博士生，具有充足的人力資源和物力資源。3.申請人簡歷與本項目有關的論文:4承擔科研項目情況：（1）前庭代償中前庭神經核內中樞化學機制研究教育部科技司博士點專項基

49、金資助。課題編號：起止時間：2008.01-2010.12經費來源：教育部科經費總額：6萬元5自然科學基金項目完成情況本研究室其他人員相關的自然基金研究完成情況項目研究小組成員：項目名稱：清醒大鼠室旁核參與血壓調節(jié)的神經化學機制編號：經費來源：國家自然基金項目起止時間：2003、012003、12該項目已經結題，除了因為各種試劑價格的提升導致的經費不足，沒能完成阻斷劑確認氨基酸的具體作用機制外基本完成預期的目的。另外，因為該課題的研究期限為一年性試探性資助，故的沒有發(fā)表論文。項目摘要：下丘腦室旁核（PVN）不僅通過控制垂體激素的釋放影響機體的內分泌功能，還直接控制或調節(jié)某些自主神經傳出纖維的活

50、動。PVN作為內分泌系統和自主神經系統的統合部位，在機體心血管活動調節(jié)中起著重要作用，但其作用機制，特別是PVN內神經化學機制還不是很清楚。因此，本研究在用電腦控制的代謝籠慢性記錄清醒狀態(tài)、自由活動大鼠的心血管活動變化的情況下，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察PVN局部細胞外液中的幾種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、古氨酰胺、甘氨酸、牛黃酸、丙氨酸等）的濃度變化，探討其對正?；驊顟B(tài)下心血管反應的影響。本研究結果顯示，用笨腎上腺素和硝普鈉誘發(fā)減壓反射時，天冬氨酸、古氨酰胺、甘氨酸出現顯著變化；旋轉刺激時，天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸出現顯著變化；高滲鹽水直接刺激PVN時，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸出

51、現顯著變化。結果提示，PVN內的幾種氨基酸可能參與心血管活動中樞調節(jié)過程，而且參與的氨基酸種類因刺激不同而異。本研究可為闡明心血管活動中樞調節(jié)機制做貢獻，還可為高血壓等心血管疾病的病因研究和診治提供一些理論依據。三、經費申請說明申請經費主要用于實驗材料購置、儀器的維修和科研業(yè)務活動支出。約需要25萬元。其主要的支出計劃如下：（一）實驗材料費，約15.5元：1動物：1.5萬元；大鼠300只（1.2萬），飼料（0.3萬）；2試劑和藥品：7.0萬元；（1）配制微量分析系統流動相的藥品約1.5萬元；（2）麻醉藥、生理鹽水、染色劑等常用試劑0.5萬元；（3）免疫組織化學試劑（c-Fos和pERK1/2）2.0萬元；（4）各種神經遞質標準品、激動劑、拮抗劑等3.0萬元；其他實驗消費品：3.5萬元；（1）微量透析套管和導管約1.5萬元；（2）動靜脈導管約0.5萬元；（3）其他1.5萬元；生物活性物質微量分析系統維持費：3.5萬元；（1）HPLC分離柱：約3.0萬元（高效液項色譜用，1個/年，每個約10萬元）；（2）碳電極等約0.5萬元；（二）儀器設備費：