納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析-硅膠包裹納米鋱熒

1、PAGE PAGE 5納米稀土熒光材料與時間分辨熒光免疫分析作 者：葉志強(qiáng), 譚明乾 指導(dǎo)教師：袁景利, 王桂蘭一室101組摘要：在在油包水水型的微微乳液中中，合成成了三種種形狀規(guī)規(guī)則、尺尺寸均勻勻的硅膠膠基質(zhì)納納米稀土土熒光材材料。與與前驅(qū)體體相比，新型熒熒光納米米微粒具具有更強(qiáng)強(qiáng)的熒光光強(qiáng)度和和抗光漂漂白性能能。將納納米微粒粒表面修修飾并標(biāo)標(biāo)記鏈酶酶親和素素SA（或抗體體）后應(yīng)應(yīng)用于時時間分辨辨熒光免免疫分析析，建立立了人血血清中前前列腺特特異抗原原（PSSA）、甲胎蛋蛋白（AAFP）和乙肝肝表面抗抗原（HHBsAAg）的的高靈敏敏度檢測測方法。關(guān)鍵詞：熒光納納米微粒粒；稀土土配合物物；生

2、物物標(biāo)記；時間分分辨熒光光免疫分分析。 時間間分辨熒熒光生物物分析技技術(shù)是基基于稀土土熒光化化合物特特殊熒光光性質(zhì)而而建立起起來的一一種高靈靈敏度分分析方法法，現(xiàn)已廣廣泛應(yīng)用用于免疫疫測定、DNAA雜交測測定和熒熒光顯微微鏡成像像測定等等生化檢檢測的領(lǐng)領(lǐng)域1。該技技術(shù)利用用具有熒熒光壽命命長、SStokkes 位移大大和半峰峰寬窄等等特點(diǎn)的的稀土熒熒光配合合物作為為標(biāo)記物物，不僅僅適用于于多標(biāo)記記分析，而且可可完全消消除各種種散亂光光和短壽壽命熒光光對測定定的干擾擾，從而而實(shí)現(xiàn)超超高靈敏敏度分析析?；谟谶@些優(yōu)優(yōu)點(diǎn)，時時間分辨辨熒光生生物分析析技術(shù)在近20年來來取得了了重大的的發(fā)展，在在臨床醫(yī)

3、學(xué)學(xué)與生命命科學(xué)的的實(shí)踐與與研究中中發(fā)揮著著重要的的作用。近年來，納米尺尺度發(fā)光光材料在在生化分分析領(lǐng)域域中的作作用受到到了越來來越多的的關(guān)注。量子點(diǎn)點(diǎn)2、膠體體金3、核殼殼型熒光光探針44等納米米顆粒作作為標(biāo)記記物已經(jīng)經(jīng)開始應(yīng)應(yīng)用于生生化檢測測領(lǐng)域。但是由由于納米米尺度的的發(fā)光粒粒子的瑞瑞利、拉拉曼和丁丁達(dá)爾散散射產(chǎn)生生的背景景光對測測定的嚴(yán)嚴(yán)重干擾擾,影響響了檢測測結(jié)果的的靈敏度度、精密度度和準(zhǔn)確確度，無無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)高靈敏敏的定量量分析。在我們的的研究中中，綜合合稀土熒熒光標(biāo)記記物和納納米技術(shù)術(shù)的優(yōu)勢勢，合成成了三種種具有長長壽命熒熒光的納納米稀土土熒光微微粒5-7。新新型納米米熒光微微粒用

4、于于時間分分辨熒光光生物分分子分析析，不僅僅可從根根本上徹徹底消除除各種散散亂光和和短壽命命熒光對對測定的的干擾，提高分分析方法法的靈敏敏度,而而且由于于熒光配配合物被被包覆在在硅膠的的骨架結(jié)結(jié)構(gòu)中,基本隔隔絕了外外部環(huán)境境對配合合物的影影響，極極大地增增強(qiáng)了熒熒光材料料的光穩(wěn)穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)部分分1.摻雜雜型納米米熒光微微粒的制制備將1600mg N,NN,N11,N1-22, 66-biis(33-amminoometthyll-1-pyyrazzolyyl)-pheenyll- ppyriidinnettetrrakiis(aacettatee)-Tbb3+（BBPTAA-Tbb3+）溶溶于

5、1.1 mml的水水后和2200l的四四乙氧基基硅（TTEOSS）攪拌拌下加入入到1000 mml的圓圓底燒瓶瓶中，然然后再分分別加入入2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g 正己醇醇和7.25gg環(huán)己烷烷，制成成W/OO型微乳乳液，在在劇烈攪攪拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正己醇、7.225g環(huán)環(huán)己烷及及2000l濃氨氨水的另另一種微微乳液。室溫攪攪拌反應(yīng)應(yīng)24小小時后，加入550 mml丙酮酮結(jié)束反反應(yīng)。將將反應(yīng)液液離心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸餾餾水各洗洗三次，真空干干燥后得

6、得到白色色硅膠包包裹BPPTA-Tb33+納米米熒光微微粒。2.摻雜雜型納米米熒光微微粒用于于測定人人血清樣樣品中的的PSAA將含抗人人PSAA單克隆隆抗體（10 g/mml）的的pH值值為9.6的00.1 moll/L的的碳酸鈉鈉緩沖溶溶液500 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 oC, 24小小時包被被后，將將PSAA標(biāo)準(zhǔn)溶溶液（用用5% BSAA-0.9% NaCCl-00.1% NaaN3的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll溶液制制備）或或血清樣樣品455 l注入入上述包包被后的的微孔板板中。337 00C，11小時反反應(yīng)后，用含有有0.005%

7、 Tweeen 20 的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll緩沖溶溶液（緩緩沖溶液液1）洗洗兩次，再用ppH值77.8的的0.005 mmol/L TTriss-HCCl緩沖沖溶液（緩沖溶溶液2）洗一次次，然后后加入445 l生物物素標(biāo)記記的抗PPSA抗抗體溶液液，377 0C，11小時反反應(yīng)后，用緩沖沖溶液11洗兩次次，緩沖沖溶液22洗一次次，再加加入455 l 納納米微粒粒標(biāo)記的的SA溶溶液，337 00C，11小時反反應(yīng)后，用緩沖沖溶液11洗4次次，然后后進(jìn)行固固相時間間分辨熒熒光測定定。 3.共聚聚合型納納米熒光光微粒的的制備將1600mg BPTTA-T

8、Tb3+溶于11.1 ml的的水后和和2000l的TTEOSS攪拌下下加入到到1000 mll的圓底底燒瓶中中，然后后再分別別加入22.377 g Triitonn X-1000、1.87 g正辛辛醇及77.255g環(huán)己己烷，制制成W/O型微微乳液，在劇烈烈攪拌下下向其中中加入含含有2.37 g TTritton X-1100、1.887 gg正辛醇醇、7.25gg環(huán)己烷烷及2000l濃氨氨水的另另一種微微乳液。室溫攪攪拌反應(yīng)應(yīng)5小時時后，加加入6 l的33-22-(22-amminooethhylaaminno)eethyylamminooprropyyl- triimetthoxxysii

9、lanne（AAEPSS），繼繼續(xù)攪拌拌19小小時后，加入550 mml丙酮酮結(jié)束反反應(yīng)。將將反應(yīng)液液離心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸餾餾水分別別洗三次次，真空空干燥后后得到白白色的共共聚合型型硅膠包包裹BPPTA-Tb33+納米米熒光微微粒。4.共聚聚合型熒熒光納米米微粒用用于測定定人血清清樣品中中的AFFP將含抗人人AFPP單克隆隆抗體（10 g/mml）的的pH值值為9.6的00.1 moll/L碳碳酸鈉緩緩沖溶液液50 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 0C, 24小小時包被被后將AAFP標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液液或血清清樣品445 l注入入上述包包被后的的微孔板板中，33

10、7 00C，11小時反反應(yīng)后，用緩沖沖溶液11洗兩次次，緩沖沖溶液22洗一次次。加入入45 l納米米熒光微微粒標(biāo)記記的抗AAFP多多抗溶液液，377 0C，11小時反反應(yīng)后，用緩沖沖溶液11洗4次次，然后后進(jìn)行固固相時間間分辨熒熒光測定定。5. 共共價鍵合合型熒光光納米微微粒的制制備將10.4mgg氨丙基基三乙氧氧基硅 (APPS，447 moll)，77.1moll4,44-biis(11, 1,1,2,2,3,3-hepptaffluooro-4,6-hexxaneedioon-66-yyl)-chlloroosullfo-o- tterpphennyl (BHHHCTT)及33.555m

11、ollEuCCl36H2O 加加入300 l環(huán)己己烷中，超聲振振蕩反應(yīng)應(yīng)15分分鐘后，反應(yīng)液液加入到到含有11.1 ml水水，4.74 g TTritton X-1100、3.664 gg正辛醇醇及144.500 g環(huán)環(huán)己烷的的W/OO型微乳乳液中，攪拌00.5小小時后，加入2200 l的TTEOSS和2000 l的濃濃氨水。室溫攪攪拌反應(yīng)應(yīng)24小小時后，加入440 mml丙酮酮結(jié)束反反應(yīng)。將將反應(yīng)液液離心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸餾餾水分別別洗三次次后懸浮浮于水中中備用。6. 共共價鍵合合型納米米微粒用用于人血血清中乙乙肝表面面抗原（HBssAg）測定使用抗HHBsAAg

12、單抗抗和多抗抗進(jìn)行測測定，測測定步驟驟與摻雜雜型納米米熒光微微粒測定定人血清清中PSSA相同同。結(jié)果和討討論 1. 摻摻雜型納納米熒光光微粒的的制備及及時間分分辨熒光光免疫測測定PSSA摻雜型納納米熒光光微粒的的制備原原理見圖圖1。在在表面活活性劑和和助表面面活性劑劑的作用用下，含有 TEOOS,BBPTAA-Tbb3+的水水溶液在在油相中中形成均均勻的小小液室，每一個個小液室室相當(dāng)于于一個微微反應(yīng)器器，TEOOS的水水合化和和聚合化化的過程程都被限限制在微微反應(yīng)器器內(nèi)。微反應(yīng)應(yīng)器的體體積主要要由水和和表面活活性劑的的比值所所決定，而微反反應(yīng)器的的體積大大小又決決定了納納米顆粒粒的尺寸寸大小。

13、我們用用這種方方法制備備了直徑徑在422 33 nmm的納米米顆粒(圖2)，由電鏡鏡照片可可以看出出納米顆顆粒形狀狀規(guī)則、尺寸均均勻。圖1 在在微乳液液中制備備納米微微粒的原原理 圖圖2 硅硅膠包裹裹BPTTA-TTb3+納米微微粒的電電鏡照片片納米熒光光微粒表表面的硅硅膠經(jīng)過過修飾后后可與生生物分子子相連。將納米米熒光微微粒與SSA共價價結(jié)合后后，可用用于時間間分辨熒熒光免疫疫測定。PSAA是前列列腺癌診診斷的一一個重要要指標(biāo)，現(xiàn)用于于臨床檢檢測的方方法主要要有放射射性免疫疫法和酶酶聯(lián)免疫疫法，它它們的檢檢測靈敏敏度大約約在1000pgg/ml左右。而最近近的研究究表明，如果方方法的檢檢測靈

14、敏敏度可達(dá)達(dá)到200 pgg/ml以下，那么至至少可以以提前一一年診斷斷出治療療后前列列腺癌患患者是否否復(fù)發(fā)。所以發(fā)發(fā)展高靈靈敏度的的血中PPSA的的檢測方方法顯得得十分重重要。使使用BPPTA-TTb3+納米微微粒標(biāo)記記SA的的時間分分辨熒光光免疫分分析法測測定PSSA的工工作曲線線如圖33所示，方法的的最低檢檢測限為為7 ppg/mml（用用本底信信號標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差的的3倍計(jì)計(jì)算）。使用本本方法對對24個個人血清清樣品的的PSAA濃度進(jìn)進(jìn)行了測測定，并并與臨床床測定的的結(jié)果進(jìn)進(jìn)行了比比較，兩兩者的相相關(guān)性見見圖4。兩種方方法對224個人人血清樣樣品中PPSA濃濃度測定定結(jié)果的的相關(guān)性性方程式式

15、為y1.001x0.0008，相關(guān)系系數(shù)為00.9998，說說明使用用納米微微粒作為為標(biāo)記物物的測定定方法的的結(jié)果是是完全可可信的。圖3用硅硅膠包裹裹BPTAA-Tbb3+納米微微粒標(biāo)記記SA 圖44 新方方法和臨臨床檢測測法用于于24個個人血清清的時間分分辨熒光光免疫測測定PSSA的工工作曲線線 樣品品中PSSA濃度度測定的的相關(guān)性性2. 共共聚合型型納米熒熒光微粒粒的制備備及時間間分辨熒熒光免疫疫測定AAFPAEPSS和TEEOS一一樣，都都可以在在氨水存存在的條條件下發(fā)發(fā)生水解解和聚合合反應(yīng)。而且它它具有的的活性基基團(tuán)-NNH2在聚合合后會存存在于納納米微粒粒的表面面，為后后續(xù)標(biāo)記記生物

16、分分子提供供極大的的方便。所以，在我們們的研究究中利用用將AEEPS和和TEOOS共聚聚合的方方法在微微乳液中中制備出出了表面面帶有活活性氨基基的功能能性硅膠膠包裹鋱鋱配合物物納米熒熒光微粒粒。其電電鏡測定定結(jié)果（見圖55）顯示示這種納納米微粒粒不僅形形狀規(guī)則則，而且且粒徑分分布范圍圍窄(4453nm)。聚合后后存在于于納米微微粒表面面的-NNH2基團(tuán)使使得生物物標(biāo)記更更加容易易。通過過簡單的的方法將將納米微微粒與抗抗AFPP抗體結(jié)結(jié)合后，建立了了一種以以納米微微粒為標(biāo)標(biāo)記物的的時間分分辨熒光光免疫分分析方法法用于人人血清中中AFPP的測定定，其工工作曲線線見圖66。本方法法的最低低檢測限限為

17、0.1 nng/mml，相相對標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差（CV%）小于于9.00%，血清清添加回回收率在在84.0-98.0%范圍，說明該該法具有有較高的的精密度度和準(zhǔn)確確度，可可以用于于人血清清樣品的的測定。圖5功能能性鋱納納米熒光光微粒的的電鏡照照片 圖6 測定定AFPP的工作作曲線3. 共共價鍵合合型納米米熒光微微粒的制制備及時時間分辨辨熒光免免疫測定定HBssAgBHHCCT-EEu3+是一種種強(qiáng)熒光光性銪配配合物，只是它它的水溶溶性較差差，所以以在用摻摻雜型方方法制備備納米微微粒時只只有少量量的配合合物被包包進(jìn)納米米微粒中中，導(dǎo)致致制得的的納米微微粒熒光光很弱。而采用用共價鍵鍵合的方方法則不不但可以

18、以增加每每個納米米微粒中中所包含含BHHHCT-Eu3+分子的的個數(shù)，從而使使得納米米微粒的的熒光強(qiáng)強(qiáng)度得到到大幅度度提高，而且一一次性地地在納米米微粒表表面導(dǎo)入入了自由由氨基。電鏡測測定結(jié)果果（見圖圖7）顯顯示該法法制得的的納米微微粒大小小均勻，粒徑為為373nm。圖7 共共價鍵合合型納米米微粒的的電鏡照照片 圖圖8. 納米微微粒標(biāo)記記SA（a）和和BHHHCT-Eu3+標(biāo)記SSA-BBSA（b）測測定人血血清中HHBsAAg的工工作曲線線將納米微微粒與SSA結(jié)合合后，用用于時間間分辨熒熒光免疫疫測定人人血清中中的HBBsAgg，其工工作曲線線見圖88a。本本法的最最低檢測測限為223pg/

19、ml，證明其其靈敏度度要高于于直接使使用BHHHCTT-Euu3+為標(biāo)標(biāo)記物的的測定方方法（圖圖8b，最低檢檢測限為為84pgg/mll）。該該法用于于人血清清樣品測測定的相相對標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)偏差小小于100%，添加回回收率在在80-1100%范圍，說明該該法具有有較高的的精密度度和準(zhǔn)確確度。結(jié)論本研究利利用微乳乳液法制制備了三三種硅膠膠基質(zhì)納納米稀土土熒光微微粒，制制備方法法簡單且且重復(fù)性性好。所所制備的的納米微微粒形狀狀規(guī)則、尺寸均均勻，在在對其進(jìn)進(jìn)行表面面修飾后后用于生生物標(biāo)記記及時間間分辨熒熒光免疫疫測定，建立了了人血清清中PSSA、AFPP及HBsAAg的高高靈敏度度定量測測定方法法。由于于

20、新型稀稀土熒光光微粒具具有強(qiáng)熒熒光、強(qiáng)強(qiáng)抗光漂漂白性能能及易用用于生物物標(biāo)記等等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)計(jì)其其在熒光光顯微鏡鏡生物成成像測定定及生物物芯片等等領(lǐng)域也也有重要要的應(yīng)用用前景，這部分分的研究究工作將將在近期期展開。注：本文文系由中中國科學(xué)學(xué)院領(lǐng)域域前沿項(xiàng)項(xiàng)目大大連化物物所青年年基金資資助參考文獻(xiàn)獻(xiàn)：Soinni, E.; Lvgrren, T.CRCC Crrit. Reev. Anaal. Cheem. 19887, 18, 1055-1554.Tayllor, J. R.;Faang, M. M.;Niee, SS. AAnall. CChemm. 20000. 72. 19779-11986

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