實(shí)驗(yàn)五用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組綠色熒光蛋白

1、 實(shí)驗(yàn)五用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組綠色熒光蛋白、目的要求學(xué).習(xí)和掌握重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù).觀察大腸桿菌在誘導(dǎo)過(guò)程中的形態(tài)。二、原理系統(tǒng)是有史以來(lái)在中克隆表達(dá)重組蛋白的功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到質(zhì)粒載體上，受噬菌體強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯可選擇信號(hào)控制；表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的聚合酶誘導(dǎo)。聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白;誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋白的50以%上。盡管該系統(tǒng)極為強(qiáng)大，卻仍能很容易地通過(guò)降低誘導(dǎo)物的濃度來(lái)削弱蛋白表達(dá)。降低表達(dá)水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分產(chǎn)量。該系統(tǒng)的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是在非

2、誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。用不含聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的可能毒性造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定詳見(jiàn)部分）如果用非表達(dá)型宿主細(xì)胞克隆，可以通過(guò)兩種方法啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)：用帶有受入和啟動(dòng)子控制的聚合酶的入噬菌體侵染宿主細(xì)胞，或者將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有受控制的聚合酶基因的表達(dá)型細(xì)胞。在第二種情形下，可以通過(guò)在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入來(lái)啟動(dòng)表達(dá)。盡管有時(shí)詳例如非毒性目的蛋白）合可以直接將目的基因克隆到表達(dá)型宿主細(xì)胞中，但這種策略并不是通用做法。兩種系7啟合動(dòng)子以及多種擁有不同抑制本底表達(dá)水平的宿主細(xì)胞共同構(gòu)成了一個(gè)極為靈活而有效的系統(tǒng)，使各種目的蛋白得以最優(yōu)化表達(dá)。合三

3、、試劑與器材合試劑：培養(yǎng)基、氨芐青霉素、草酸銨結(jié)晶紫染色液，路哥氏（）碘液，乙醇,沙黃染色液。器材：搖床、顯微鏡等。四、操作步驟A、誘導(dǎo)許多研究表明細(xì)胞生長(zhǎng)速率嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)，因此必須對(duì)接種菌量、誘導(dǎo)前細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間和誘導(dǎo)后細(xì)胞密度進(jìn)行控制。生長(zhǎng)過(guò)度或過(guò)速都會(huì)加重細(xì)菌合成系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致形成包涵體。對(duì)照菌和重組菌分別挑取個(gè)菌落，接入含氨芐青霉素（00）的培養(yǎng)液，7培養(yǎng)過(guò)夜。大腸桿菌在室溫的生長(zhǎng)速率比在C慢倍，所以C培養(yǎng)過(guò)夜（）可能達(dá)不到飽和。但低溫時(shí)細(xì)菌代謝緩慢，不容易形成包涵體。取M過(guò)夜培養(yǎng)物接入含氨芐青霉素（0J）的培養(yǎng)液，7振蕩培養(yǎng)以上,至對(duì)數(shù)中期（）。在培養(yǎng)物中加入至終濃度，繼續(xù)

4、振蕩培養(yǎng)。的濃度對(duì)表達(dá)水平影響非常大。只是一個(gè)起點(diǎn)，也是一個(gè)比較高的濃度。實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)在的范圍內(nèi)改變濃度，尋找最佳使用濃度。對(duì)于有些蛋白，必須誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒慢轉(zhuǎn)錄，才不致于使細(xì)菌的生物合成系統(tǒng)過(guò)載。在誘導(dǎo)的前后取樣品放于微量離心管中，測(cè)定，室溫高速離心。留樣并觀察形態(tài)。b形態(tài)觀察1涂片將誘導(dǎo)前后的大腸桿菌分別作涂片(注意涂片切不可過(guò)于濃厚)，干燥、固定。固定時(shí)通過(guò)火焰一次即可，不可過(guò)熱，以載玻片不燙手為宜。2染色()初染加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗脫色將載玻片上的水甩凈，并襯以白背景，用95酒%精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約23分鐘，立即用水沖凈酒精。復(fù)染用番紅液染12分鐘，水洗。鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過(guò)度，則陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。注意事項(xiàng)革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過(guò)度，革蘭氏陽(yáng)性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭氏陰性菌；如脫色時(shí)間過(guò)短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被誤認(rèn)為是革蘭氏陽(yáng)性菌。因此必須嚴(yán)